Espectrofotometría de absorción molecular: concepto, leyes de absorción, instrumentación visible-ultravioleta, fuentes comunes de error y utilización en el análisis de agua

La espectrofotometría de absorción molecular UV-visible es un método instrumental óptico basado en la medida de la absorción de radiación electromagnética ultravioleta-visible por las moléculas del analito. Es una de las técnicas más extendidas en el laboratorio de aguas para determinar especies que absorben por sí mismas o que se convierten en compuestos coloreados.

1. Concepto

1.1. Métodos ópticos y radiación electromagnética

Los métodos ópticos miden alguna propiedad de la radiación emitida por la materia o que interacciona con ella. Son espectroscópicos si hay intercambio de energía (métodos de absorción y de emisión) y no espectroscópicos si solo cambian la dirección o propiedades de la radiación (dispersión, refracción, difracción, rotación óptica).

La radiación electromagnética se describe como onda (longitud de onda λ, frecuencia ν, amplitud; potencia P = energía que llega por unidad de área y tiempo) y como flujo de fotones de energía E = h·ν = h·c/λ: al aumentar λ disminuyen la energía y la frecuencia. La región ultravioleta comprende de 10 a 400 nm y la visible de 350 a 750 nm aproximadamente.

1.2. Absorción

La absorción es el proceso por el cual una especie capta selectivamente ciertas frecuencias: el fotón la lleva de su estado fundamental a un estado excitado (M + hν → M*), que pierde la energía en unos 10⁻⁸-10⁻⁹ s, generalmente como calor. Para que haya absorción debe existir interacción entre el campo eléctrico de la radiación y alguna carga de la sustancia, y la energía del fotón debe ser exactamente igual a la diferencia entre dos estados permitidos (ΔE = h·ν). En las moléculas, la radiación UV-visible excita electrones de enlace; cada estado electrónico tiene varios niveles vibracionales y rotacionales, por lo que se obtienen espectros de bandas.

• Especies absorbentes: moléculas orgánicas y aniones inorgánicos con electrones σ, π o no enlazantes n; transiciones σ→σ*, n→σ*, π→π* y n→π*.

• Cromóforo: grupo que lleva asociada una banda de absorción (C=C, C=O, C=N; dobles y triples enlaces). Auxocromo: grupo que no absorbe por sí mismo pero intensifica la absorción del cromóforo (C-Br, C-OH). Las bandas de campo ligando explican el color de muchos iones de metales de transición (orbitales d y f).

• Color: una disolución muestra el color complementario del absorbido; una disolución amarilla absorbe luz azul (450-480 nm).

• Espectro de absorción: absorbancia frente a λ; el máximo (λmax) da la mayor sensibilidad y es la longitud de onda elegida para el análisis.

1.3. Transmitancia y absorbancia

• Transmitancia: T = P/P₀ (de 0 a 1, o de 0 a 100 %).

• Absorbancia: A = −log T = log P₀/P. Si no hay absorción, A = 0; si se absorbe el 99 % de la radiación (se transmite el 1 %), A = 2.

2. Leyes de absorción de la luz

• Ley de Lambert: efecto del espesor del medio sobre la fracción de radiación absorbida.

• Ley de Beer: efecto de la concentración.

• Ley de Lambert-Beer: la absorbancia es directamente proporcional al camino óptico b y a la concentración c: A = a · b · c, donde a es la absortividad (L/(cm·g) si c está en g/L). Si c se expresa en mol/L, la constante es la absortividad molar ε (L/(cm·mol)): A = ε · b · c. ε es característica de cada especie a cada λ.

• Aditividad: en una mezcla, a cada λ, A(total) = ε₁·b·c₁ + ε₂·b·c₂ + … + εₙ·b·cₙ.

Comprobación: curva de calibrado. Se preparan disoluciones patrón en el intervalo en que se espera la muestra, se mide su absorbancia a λmax (generalmente con cubeta de 1 cm) y se representa A frente a c; si se cumple la ley se obtiene una recta que pasa por el origen. La proporcionalidad solo se cumple en un intervalo lineal; fuera de él aparecen desviaciones positivas o negativas, y las medidas de la muestra deben quedar dentro de ese intervalo.

3. Instrumentación visible-ultravioleta

Componentes básicos: fuente de energía radiante → selector de λ → cubeta con la muestra → detector → dispositivo de lectura.

• Haz sencillo: fuente, selector, cubeta (de muestra o de referencia, alternativamente), detector, amplificador y registro.

• Doble haz: el haz se reparte entre la cubeta de muestra y la de referencia, con dos fotoceldas y un amplificador diferencial.

Verificación y calibración del espectrofotómetro (mediante autocomprobaciones del equipo o patrones externos):

• Exactitud de la longitud de onda: filtro de vidrio con óxido de holmio (máximos de referencia en 241,5; 279,4; 287,5; 333,7; 360,9; 418,4; 453,2 y 536,2 nm).

• Exactitud de la absorbancia: en el UV, dicromato potásico de 0,05 g/L en H₂SO₄ 0,005 M (p. ej., A = 0,727 en el máximo de 257 nm); en el visible, sulfato de cobre de 20,0 g/L en H₂SO₄ al 1 %.

• Linealidad de la respuesta, diluyendo las disoluciones anteriores. Si el resultado sale del criterio de aceptación, el equipo debe calibrarse o repararse.

4. Fuentes comunes de error

4.1. Limitaciones de la ley de Beer

• Propias o reales: la absortividad varía con el índice de refracción, que cambia con la concentración; la ley se cumple para c < 0,01 M.

• Incumplimiento de sus premisas: interacciones del soluto con la radiación distintas de la absorción, interacciones entre especies absorbentes y radiación no monocromática.

4.2. Errores químicos

• Equilibrios que modifican la especie absorbente: dimerización, ácido-base y complejación.

• Efectos del disolvente.

• Impurezas absorbentes de los reactivos.

• Interferencias absorbentes presentes en la muestra.

4.3. Errores instrumentales

• Errores de lectura: el mínimo error relativo se obtiene para una absorbancia de 0,434, y conviene trabajar con absorbancias entre 0,2 y 0,8.

• Radiación parásita.

4.4. Errores personales

• Utilización y cuidado de las cubetas de absorción.

• Control de la temperatura.

Para minimizarlos se controlan las variables que influyen en la absorbancia (disolvente, pH, temperatura, concentración alta de electrolito, sustancias interferentes) y se elige el método de calibración: patrones externos (los patrones deben parecerse lo más posible a la composición de las muestras) o adiciones estándar (de un solo punto o múltiples), útil para contrarrestar los efectos de matriz en muestras complejas: en las adiciones múltiples, la concentración de la muestra se obtiene del cociente entre la ordenada en el origen y la pendiente de la recta.

5. Utilización en el análisis de agua

Los métodos espectrofotométricos tienen amplia aplicabilidad, elevada sensibilidad (límites de detección de 10⁻⁴ a 10⁻⁵ M), selectividad de moderada a alta, buena exactitud (errores del 1-5 %) y fácil automatización. Las especies que no absorben se determinan haciéndolas reaccionar con un reactivo que forma un compuesto absorbente (colorimetría): la concentración se obtiene de una curva de calibración con patrones del analito.

• Hierro: complejo rojo-anaranjado del Fe²⁺ con 1,10-fenantrolina, muy útil en aguas naturales; previamente se reduce el Fe³⁺ con hidroxilamina y se ajusta el pH con acetato sódico; el complejo absorbe entre 490 y 510 nm.

• Fosfatos: en medio ácido, el ortofosfato forma con molibdato y vanadato el ácido vanado-molibdo-fosfórico amarillo, cuya intensidad es proporcional a la concentración; se mide entre 400 y 490 nm (opcionalmente a 420 nm).

• Sulfatos: método turbidimétrico: precipitación con Ba²⁺ en medio ácido en condiciones que forman cristales de BaSO₄ de tamaño uniforme mantenidos en suspensión, midiendo la radiación transmitida.

• Nitratos y nitritos: la OMS cita límites de detección de 0,01-1 mg/L de nitrato mediante técnicas espectrométricas y de 0,005-0,01 mg/L de nitrito por espectrometría de absorción molecular (valores paramétricos del RD 3/2023: 50 mg/L de nitrato y 0,50 mg/L de nitritos en red).

• Amonio, color y demanda química de oxígeno (DQO por el método de tubo cerrado) en laboratorios de aguas, así como analizadores de flujo segmentado con detección espectrofotométrica para nitrógeno total, cianuro total y detergentes aniónicos (sustancias activas al azul de metileno).

• Materia orgánica: la absorción de luz UV (190-380 nm) permite estimar cualitativamente la presencia de sustancias orgánicas, por su correlación con el contenido de carbono orgánico.

• Turbidez: puede medirse con espectrofotómetro (turbidimetría), aunque el método habitual es el nefelométrico.

Fuentes: Universidad de Murcia (OCW), Análisis Químico, tema 8 «Técnicas espectrofotométricas de absorción ultravioleta-visible» (https://www.um.es/web/innovacion/plataformas/ocw/listado-de-cursos/analisis-quimico-2012-/material-de-clase); Universidad Politécnica de Madrid, J. V. Alonso Felipe, «Prácticas con técnicas instrumentales de análisis físico-químico», 2021, prácticas V-UV 01 a 03 bis (https://oa.upm.es/42341/); OMS, Guías para la calidad del agua potable, 3.ª ed., primer apéndice, apartados 8.3.2 y 12 (https://sswm.info/sites/default/files/reference_attachments/OMS%202006.%20Gu%C3%ADa%20para%20la%20calidad%20dl%20agua%20potable.pdf); Universidade da Coruña, SAI, Unidad de Análisis de Aguas (https://www.sai.udc.es/es/unidades/UAA); Real Decreto 3/2023, anexo I (https://www.boe.es/buscar/act.php?id=BOE-A-2023-628). Consultadas el 07/10/2026.