Análisis bacteriológico de alimentos: toma de muestras, preparación y recuento de microorganismos indicadores por filtración y número más probable

El análisis microbiológico de un alimento responde a una pregunta concreta: si el producto o el proceso que lo ha producido cumplen un criterio microbiológico. En la Unión Europea los criterios los fija el Reglamento (CE) n.º 2073/2005 de la Comisión, de 15 de noviembre de 2005, que también establece los métodos de referencia y los planes de muestreo. Los microorganismos indicadores (aerobios, enterobacteriáceas, coliformes, E. coli) informan sobre la higiene del proceso y la calidad microbiológica global.

1. Marco: criterios microbiológicos

Definiciones del artículo 2 del Reglamento (CE) 2073/2005:

• Microorganismos: bacterias, virus, hongos, mohos, algas, protozoos parásitos, helmintos parásitos microscópicos y sus toxinas y metabolitos.

• Criterio microbiológico: criterio que define la aceptabilidad de un producto, un lote o un proceso según la ausencia, presencia o número de microorganismos, o la cantidad de sus toxinas o metabolitos, por unidad de masa, volumen, superficie o lote.

• Criterio de seguridad alimentaria: define la aceptabilidad de un producto o lote y se aplica a los productos comercializados (por ejemplo, Salmonella o Listeria monocytogenes).

• Criterio de higiene del proceso: indica el funcionamiento aceptable del proceso de producción; no se aplica a productos comercializados y fija un valor por encima del cual se requieren medidas correctoras. Es el ámbito propio de los indicadores.

• Lote: conjunto de productos obtenidos en circunstancias prácticamente idénticas, en un lugar y periodo determinados.

• Muestra: una o varias unidades, o una porción de materia, seleccionada de una población para informar sobre ella y servir de base a una decisión. Muestra representativa: la que mantiene las características del lote; en particular, una muestra aleatoria simple.

2. Toma de muestras

2.1. Planes de muestreo

Los criterios del anexo I se expresan con un plan de muestreo y unos límites:

Ejemplo (criterio de higiene del proceso para carne picada, al final de la fabricación): recuento de colonias aerobias con n = 5, c = 2, m = 5 × 10⁵ ufc/g y M = 5 × 10⁶ ufc/g (método EN ISO 4833-1), y E. coli con n = 5, c = 2, m = 50 ufc/g y M = 500 ufc/g (ISO 16649, partes 1 o 2). Interpretación:

• Satisfactorio: todos los valores ≤ m.

• Aceptable: como máximo c/n valores entre m y M y el resto ≤ m.

• Insatisfactorio: uno o más valores > M, o más de c/n valores entre m y M.

En caso de resultado insatisfactorio en carne picada, el reglamento indica mejoras en la higiene de la producción y en la selección u origen de las materias primas.

2.2. Normas de muestreo

• Como métodos de referencia se aplican los métodos analíticos y los planes y métodos de toma de muestras del anexo I (artículo 5).

• En las zonas de trabajo y el equipo se usa como referencia la norma ISO 18593; los productores de alimentos listos para el consumo con riesgo de L. monocytogenes deben muestrear siempre esas zonas.

• A falta de normas más específicas, para la recogida y preparación de las muestras se usan las normas ISO pertinentes y las directrices del Codex Alimentarius (anexo I, capítulo 3.1). En canales, la norma ISO 17604.

• El número de unidades puede reducirse si la empresa demuestra con documentación histórica procedimientos eficaces basados en el APPCC; para evaluar la aceptabilidad de un lote concreto se respetan como mínimo los planes del anexo I.

2.3. Recogida práctica, envío y conservación

Según la SEIMC:

• Los alimentos comercializados se recogen en los establecimientos de venta final.

• En alimentos envasados, la unidad de muestreo es el envase (mínimo 100 g o 100 mL, o la docena en huevos); a granel, al menos 100 g o 100 mL, en varias porciones de distintos puntos, en bolsas estériles.

• Las muestras se transportan refrigeradas entre 2 y 8 ºC y se procesan antes de 24 horas. La refrigeración puede matar algunas bacterias (Salmonella, Campylobacter); si se van a hacer recuentos, hay que garantizar que no haya multiplicación ni muerte antes del análisis.

3. Preparación de la muestra

3.1. Suspensión inicial y diluciones decimales

La preparación de las muestras de análisis, la suspensión inicial y las diluciones decimales se rigen por la serie UNE-EN ISO 6887 (partes 1 a 6: reglas generales, carne, pescado, otros productos, leche y producción primaria), citada por ENAC.

Procedimiento práctico (Universidad de La Rioja):

1. Pesar asépticamente 25 g del alimento en una bolsa estéril de Stomacher y añadir 225 mL de agua de peptona al 0,1 %.

2. Homogeneizar en el Stomacher: se obtiene la suspensión madre, que es la dilución 1:10. En alimentos líquidos (leche, zumo) la suspensión madre es el propio alimento.

3. Preparar tubos con 9 mL de diluyente y transferir 1 mL de la suspensión madre al primero (1:100); repetir con pipetas nuevas hasta obtener la serie de diluciones decimales.

La SEIMC indica que las muestras sólidas se mezclan con un líquido estéril (por ejemplo, agua de peptona tamponada) en proporciones peso/volumen entre 1:1 y 1:9; se homogeneizan (por ejemplo, con homogeneizadores de palas) y se dejan reposar 10-15 minutos antes de tomar la muestra analítica de la fracción líquida. La cantidad inicial suele ser de 10 g, y de 25 g para Salmonella.

4. Microorganismos indicadores en alimentos

5. Recuento de indicadores por número más probable

El NMP se usa en alimentos sobre todo para concentraciones bajas y cuando las partículas del alimento interfieren en el recuento de colonias (FDA).

5.1. Coliformes (Universidad de La Rioja)

1. Preparar la suspensión madre y las diluciones 1:10, 1:100 y 1:1.000.

2. Tres series de tres tubos de caldo lactosado biliado al verde brillante (BGBL) con campana de Durham.

3. Sembrar 1 mL de cada dilución en los tres tubos de su serie.

4. Incubar a 31 ºC durante 24-48 horas. Es positivo el tubo con gas en al menos el 20 % de la campana, por fermentación de la lactosa.

5. Con el número de tubos positivos de cada serie se consulta la tabla del NMP: resultado en coliformes/g o /mL.

5.2. E. coli a partir de los coliformes

1. Subcultivar cada tubo positivo en BGBL con campana e incubar a 45 ºC durante 24-48 horas: los tubos con gas son presuntivos de E. coli.

2. Sembrar en agar Levine (eosina-azul de metileno): las colonias de E. coli tienen centro azul-negro con brillo metálico verdoso a la luz reflejada.

3. Confirmar con la producción de indol (reactivo de Kovacs) en agua de peptona; si hace falta, pruebas IMViC.

4. Leer la tabla del NMP para obtener E. coli/g o /mL.

5.3. Un criterio expresado en NMP

En moluscos bivalvos vivos (y equinodermos, tunicados y gasterópodos marinos vivos), el criterio de seguridad alimentaria para E. coli se expresa en NMP por 100 g de carne y líquido intravalvar: n = 5, c = 1, m = 230 NMP/100 g y M = 700 NMP/100 g, con método de referencia EN/ISO 16649-3. Es satisfactorio si los cinco valores son ≤ 230, o si uno supera 230 sin pasar de 700; insatisfactorio si alguno supera 700 o al menos dos superan 230.

6. Recuento de indicadores por filtración

• El fundamento es el descrito para el agua: un volumen conocido de muestra líquida pasa por una membrana de 0,45 µm que retiene las bacterias; la membrana se incuba sobre un medio de cultivo y se cuentan las colonias. Es adecuada para muestras con bajos niveles de contaminación y poco turbias (Universidad de La Rioja; Universidad Miguel Hernández). Entre las aguas, el Instituto de Toxicología de la Defensa fija para las aguas envasadas un volumen mínimo de 1 L por muestra.

• En el Reglamento (CE) 2073/2005, los criterios de higiene del proceso para E. coli en carne picada y quesos tienen como método de referencia la ISO 16649 partes 1 o 2. La parte 1 lleva por título, en su versión UNE, Técnica de recuento de colonias a 44 ºC utilizando membranas y 5-bromo-4-cloro-3-indolil β-D-glucurónido: es un recuento de E. coli β-glucuronidasa positivo en el que interviene una membrana y un sustrato cromogénico.

• Los resultados se expresan en ufc/g o ufc/mL a partir de la cantidad analizada y la dilución.

7. Recuento en placa de aerobios mesófilos (referencia)

Aunque el epígrafe se centra en filtración y NMP, el indicador más usado en alimentos se cuenta en placa: 1 mL de cada dilución en placa vacía, 15 mL de PCA atemperado a unos 47 ºC (sin superar 10 minutos entre depositar la muestra y verter el medio), mezcla, solidificación, incubación invertida a 31 ºC durante 72 horas y recuento de las placas con colonias contables (Universidad de La Rioja).

Fuentes: Reglamento (CE) n.º 2073/2005 de la Comisión, de 15 de noviembre de 2005, relativo a los criterios microbiológicos aplicables a los productos alimenticios, en el espejo del BOE (DOUE-L-2005-82539, https://www.boe.es/buscar/doc.php?id=DOUE-L-2005-82539) y en su texto consolidado vigente a 01/07/2026 (Oficina de Publicaciones de la UE, CELEX 02005R2073-20260701: http://publications.europa.eu/resource/celex/02005R2073-20260701), artículos 2 y 5 y anexo I; SEIMC, Procedimiento n.º 58, Técnicas microbiológicas de detección de microorganismos multirresistentes en animales, alimentos y muestras ambientales, 2016 (https://seimc.org/wp-content/uploads/2025/06/seimc-procedimientomicrobiologia58.pdf); Universidad de La Rioja, S. A. Sanz Cervera, Prácticas de Microbiología, 2.ª ed., 2011, capítulos V y VI (https://dialnet.unirioja.es/descarga/libro/100835.pdf); Universidad Miguel Hernández, Prácticas de Microbiología: Análisis microbiológico del agua (https://sites.google.com/a/goumh.umh.es/practicas-de-microbiologia/indice/analisis-microbiologico-del-agua); ENAC, CEA-ENAC-20 Rev. 2, 2023, referencias (https://www.enac.es/documents/7020/5bdcf1e4-5598-4194-a076-125690f60654); U.S. FDA, Bacteriological Analytical Manual, Appendix 2, 2023 (https://www.fda.gov/media/183668/download); AENOR, ficha de la norma UNE-ISO 16649-1:2013 (https://tienda.aenor.com/p/norma-une-iso-16649-1-2013-n0050601); Instituto de Toxicología de la Defensa, Análisis de aguas: condiciones generales para la toma de muestras, 2016 (https://www.defensa.gob.es/documents/999074/1000840/ANALISIS_DE_AGUAS_TOMA_DE_MUESTRAS_PISCINAS.pdf). Consultadas el 07/10/2026.