Análisis bacteriológico del agua: toma de muestras y recuento de microorganismos indicadores por filtración y número más probable
El agua vehicula fácilmente microorganismos, algunos patógenos y otros que, sin serlo, delatan una contaminación fecal. Como buscar cada patógeno sería inviable, se buscan microorganismos indicadores. En España los requisitos del agua de consumo los fija el Real Decreto 3/2023, de 10 de enero: el laboratorio debe conocer qué parámetros microbiológicos exige, cómo se toma la muestra y qué métodos de recuento admite.
1. Microorganismos indicadores
Los indicadores de contaminación fecal son microorganismos que viven normalmente en el intestino del hombre y de los animales: su presencia en el agua indica contaminación fecal y, por tanto, riesgo de patógenos cuyo hábitat es también el intestino (Universidad de La Rioja).
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Bacterias coliformes: enterobacterias que fermentan la lactosa con producción de ácido en presencia de sales biliares (géneros Escherichia, Enterobacter, Citrobacter, Klebsiella). Viven también en suelo y plantas, por lo que como indicadores fecales no son muy específicos.
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Escherichia coli: el coliforme más estrechamente relacionado con el origen fecal y el testigo más específico de contaminación fecal reciente.
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Enterococos intestinales (el manual de la Universidad de La Rioja trata el grupo como «estreptococos fecales», indicadores de contaminación fecal junto a los coliformes).
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Clostridium perfringens (incluidas sus esporas).
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Colífagos somáticos (bacteriófagos).
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Recuento de colonias a 22 ºC (microorganismos cultivables heterótrofos).
2. Parámetros microbiológicos del agua de consumo (RD 3/2023, anexo I)
| Parámetro | Valor paramétrico | Unidad | Observaciones |
|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 0 | UFC o NMP en 100 mL | Parte A |
| Enterococo intestinal | 0 | UFC o NMP en 100 mL | Parte A |
| Clostridium perfringens (incluidas las esporas) | 0 | UFC en 100 mL | Parte A. Si es positivo y la turbidez supera 4 UNF, se determinará Cryptosporidium u otros que señale la autoridad sanitaria |
| Legionella spp. | 100 | UFC en 1 L | Parte A. Si se supera, identificar si es L. pneumophila y su serogrupo |
| Bacterias coliformes | 0 | UFC o NMP / 100 mL | Parte C (indicador). Valor de no aptitud: 100 UFC/100 mL |
| Recuento de colonias a 22 ºC | 100 | UFC / 1 mL | Parte C. A la salida del tratamiento, no aptitud: 1.000 UFC/1 mL |
| Colífagos somáticos | 0 | UFP / 100 mL | Parte C |
Para el real decreto, el agua es apta cuando no contiene microorganismos, parásitos o sustancias en cantidad que suponga un riesgo y cumple los valores de las partes A y B. Superar un parámetro de la parte C no presupone que el agua no sea apta, pero obliga a medidas correctoras (la superación de coliformes indica, según la nota del anexo, que no ha habido una buena desinfección o que ha existido recontaminación). En las unidades de cuidados aumentados de hospitales, Legionella spp. debe ser «no detectable/L» en los grifos asistenciales y se controla además Pseudomonas aeruginosa (menos de 1 UFC/100 mL).
3. Toma de muestras
3.1. Normas aplicables
El RD 3/2023 (anexo III, parte A) dispone que las muestras para parámetros microbiológicos se tomen y manipulen según la norma UNE-EN ISO 19458 (Calidad del agua. Muestreo para el análisis microbiológico), tanto en el grifo del usuario como en la red de distribución, salida de ETAP o depósito; para estas últimas, además, según la UNE-ISO 5667-5.
3.2. Envases y conservación
Según el Instituto de Toxicología de la Defensa:
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Muestra simple, tomada en el punto de muestreo (nunca compuesta ni integrada).
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Envases de vidrio neutro o plástico, limpios y estériles (autoclave 120 ºC/30 minutos o calor seco 180 ºC/2 horas).
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Si el agua puede tener restos de desinfectante, se neutralizan en el momento del muestreo con envases estériles con al menos 20 mg de tiosulfato sódico por litro; el tiosulfato no afecta a la muestra y puede usarse también en aguas no cloradas. Sin esos envases, el agua debe llegar al laboratorio en 15 minutos.
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No llenar del todo el envase, para poder homogeneizar la muestra.
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Volumen mínimo 500 mL (en aguas envasadas, 1 L por muestra).
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Rotular el envase y acompañarlo de un informe: origen, fecha y hora, determinaciones in situ (cloro, pH, temperatura) y si el agua está tratada.
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Analizar preferiblemente antes de 6 horas (tiempo exigible ante una reclamación legal); como máximo 24 horas, en oscuridad y refrigerada entre 2 y 8 ºC. Nunca congelar. Transporte refrigerado a 2-8 ºC.
3.3. Técnica según el punto de muestreo
| Punto | Procedimiento |
|---|---|
| Grifo, para conocer la calidad de la red | Grifo limpio y sin accesorios próximo a la conducción: raspar la suciedad, abrir y cerrar varias veces, desinfectar por flameado, dejar correr a caudal medio hasta que la temperatura sea constante y llenar en asepsia |
| Grifo, para conocer el agua tal como se suministra | Retirar alcachofas y accesorios, desinfectar el grifo (flameado o, si no es posible, hipoclorito, etanol o isopropanol), dejar correr mínimamente y llenar sin cerrar el grifo |
| Grifo, para conocer el agua tal como se consume (por ejemplo, en epidemias) | Sin retirar accesorios ni desinfectar |
| Pozos con bomba | Bombeo prolongado hasta temperatura y conductividad constantes (o tres veces el volumen del pozo) si se quiere conocer el agua subterránea |
| Lagos y ríos | Lejos de la orilla, sin remover el fondo; frasco invertido sumergido y volteado contra la corriente (no requiere tiosulfato) |
| Piscinas | Grifo del circuito y vaso, a 10-30 cm bajo la superficie, en la zona más alejada de la entrada |
4. Métodos de recuento
4.1. Métodos oficiales (RD 3/2023, anexo III, parte C)
| Parámetro | Norma | Método |
|---|---|---|
| E. coli y bacterias coliformes | UNE-EN ISO 9308-1 / UNE-EN ISO 9308-2 | Filtración por membrana (aguas con poca microbiota) / Número más probable |
| Enterococos intestinales | UNE-EN ISO 7899-2 | Filtración de membrana |
| Recuento de colonias a 22 ºC | UNE-EN ISO 6222 | Siembra en agar nutritivo |
| Clostridium perfringens | UNE-EN ISO 14189 | Filtración en membrana |
| Legionella spp. | UNE-EN ISO 11731 | Recuento por cultivo (la qPCR puede usarse como complemento) |
| Colífagos somáticos | UNE-EN ISO 10705-2 | Recuento de bacteriófagos |
Se admiten métodos alternativos evaluados por equivalencia (UNE-EN ISO 17994 o UNE-EN ISO 16140) y publicados por el Ministerio de Sanidad. Los laboratorios deben tener acreditados por la UNE-EN ISO/IEC 17025 los métodos de los parámetros que analizan (salvo control operacional y de rutina).
4.2. Filtración por membrana
Fundamento: se hace pasar un volumen conocido de agua, normalmente 100 mL, por una membrana estéril de 0,45 µm que retiene las bacterias; la membrana se coloca sobre un medio de cultivo selectivo, los nutrientes difunden a través de ella y cada bacteria retenida forma una colonia que se cuenta. Permite discriminar las aguas aptas y no aptas de forma más rápida, económica y sencilla que el NMP y sirve para aguas con bajos niveles de contaminación. Si el agua es muy turbia, la filtración no es correcta.
Procedimiento (Ministerio de Sanidad, método TSC-MUP):
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Colocar la membrana estéril (47 mm de diámetro, 0,45 µm) sobre la base de filtración y el embudo estéril encima.
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Agitar el frasco, llenar el embudo con el volumen seleccionado y aplicar vacío.
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Con pinzas flameadas, pasar la membrana al medio con la superficie de filtración hacia arriba y sin burbujas entre membrana y medio.
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Incubar; contar las colonias características y calcular el resultado en UFC/100 mL a partir del volumen filtrado.
Ejemplos de métodos autorizados por el Ministerio de Sanidad:
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Coliformes y E. coli en agar cromogénico (ACC): membrana de ésteres de celulosa de 0,45 µm; incubación 21 ± 3 horas a 36 ± 2 ºC. Las colonias rosa asalmonado a rojo (β-galactosidasa positivas, β-glucuronidasa negativas) son coliformes distintos de E. coli; las azul oscuro a violeta (ambas positivas) son E. coli. Coliformes totales = suma de ambas.
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Clostridium perfringens en TSC-MUP: incubación en anaerobiosis a 44 ± 1 ºC durante 21 ± 3 horas; entre filtración e incubación no deben pasar más de 30 minutos. Son presuntivas las colonias negras o grises (por el sulfuro de hierro) y se confirman las que muestran halo fluorescente con luz UV de 365 nm (fosfatasa ácida sobre el sustrato MUP).
En prácticas universitarias la membrana se incuba, por ejemplo, sobre agar MacConkey (coliformes, colonias rojas), Levine (E. coli, colonias verde metálico), KAA (enterococos, halos negros) o agar para C. perfringens (colonias negras) (Universidad Miguel Hernández).
4.3. Número más probable (NMP)
Fundamento: se siembran volúmenes decrecientes de la muestra en series de tubos de caldo y se cuentan los tubos positivos; el resultado se lee en las tablas del NMP y se expresa en NMP/100 mL.
Procedimiento clásico (3 series de 3 tubos con 10 mL de medio): 10 mL de muestra en cada tubo de la primera serie (con el medio a doble concentración), 1 mL en la segunda y 0,1 mL en la tercera. La positividad se manifiesta, según el caso, por gas en la campana de Durham, turbidez o viraje del indicador. Para coliformes se usa, por ejemplo, caldo lactosado biliado al verde brillante; los tubos positivos se confirman para E. coli a 45 ºC y con la prueba del indol (Universidad de La Rioja). El volumen de muestra necesario es mayor que en la filtración: 250 mL para NMP frente a 100 mL para membranas filtrantes, según ese manual.
Variantes autorizadas por el Ministerio de Sanidad (tecnología de sustrato definido, bandejas de 51 pocillos):
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Coliformes y E. coli: 100 mL de muestra con una dosis de sustrato, sellado en bandeja e incubación 18-22 horas a 36 ± 2 ºC; pocillos amarillos = coliformes; amarillos con fluorescencia azulada a 365 nm = E. coli.
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Enterococos: incubación 24-28 horas a 41 ± 0,5 ºC; el medio pasa de azul a verde en los pocillos positivos (β-glucosidasa); no necesita luz UV.
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En ambos, la ausencia de pocillos positivos equivale a 0 UFC/100 mL.
4.4. Filtración o NMP
| Filtración por membrana | NMP | |
|---|---|---|
| Resultado | Recuento directo (UFC/100 mL) | Estimación estadística (NMP/100 mL) |
| Cuándo | Aguas con bajos niveles de contaminación y sin turbidez alta | Concentraciones bajas y muestras cuyas partículas impiden contar colonias (FDA) |
| Rapidez y coste | Más rápida, económica y sencilla | Más laboriosa; más volumen de muestra (250 mL frente a 100 mL) |
| Normas del RD 3/2023 | ISO 9308-1, 7899-2, 14189 | ISO 9308-2 |
4.5. Concentración para recuentos bajos
Para microorganismos que se buscan en volúmenes grandes, como Legionella (valor paramétrico por litro), la muestra se concentra por filtración en aguas limpias o por centrifugación en aguas turbias (SEIMC).
Fuentes: Real Decreto 3/2023, de 10 de enero, anexos I y III (https://www.boe.es/buscar/act.php?id=BOE-A-2023-628); Ministerio de Sanidad, Métodos microbiológicos alternativos en agua de consumo, 2023 (https://www.sanidad.gob.es/areas/sanidadAmbiental/calidadAguas/aguasConsumoHumano/publicaciones/docs/2023_METODOS_MICROBIOLOGICOS_ALTERNATIVOS.pdf); Instituto de Toxicología de la Defensa, Análisis de aguas: condiciones generales para la toma de muestras, FTTM06 rev. 3, 2016 (https://www.defensa.gob.es/documents/999074/1000840/ANALISIS_DE_AGUAS_TOMA_DE_MUESTRAS_PISCINAS.pdf); Universidad de La Rioja, S. A. Sanz Cervera, Prácticas de Microbiología, 2.ª ed., 2011, capítulos V y VI (https://dialnet.unirioja.es/descarga/libro/100835.pdf); Universidad Miguel Hernández, Prácticas de Microbiología: Análisis microbiológico del agua (https://sites.google.com/a/goumh.umh.es/practicas-de-microbiologia/indice/analisis-microbiologico-del-agua); SEIMC, Procedimiento n.º 20, PNT-LP-02 (https://seimc.org/wp-content/uploads/2025/06/seimc-procedimientomicrobiologia20.pdf); U.S. FDA, Bacteriological Analytical Manual, Appendix 2, 2023 (https://www.fda.gov/media/183668/download). Consultadas el 07/10/2026.