El control de calidad en el laboratorio de microbiología: control de medios, control de técnicas, utilización de materiales de referencia y control de equipos

El programa de control de calidad interno asegura que la información que genera el laboratorio es exacta, adecuada y reproducible: permite vigilar de forma continua sus actividades, verificar cada lote de reactivos, cada serie analítica y los equipos, detectar desviaciones y tomar decisiones (SEIMC). En microbiología es especialmente importante porque no siempre es posible caracterizar del todo el funcionamiento de los ensayos (ENAC). Se completa con el control externo (intercomparaciones).

1. Principios generales

• Personal: personal técnico cualificado con experiencia en microbiología; supervisión e interpretación por un facultativo especialista. Debe designarse un supervisor de calidad, que revisa mensualmente los datos del control interno.

• Procedimientos escritos para cada técnica, disponibles para todo el personal y revisados anualmente.

• Registro de todo: controles, resultados, medidas adoptadas y persona que los hizo. Los registros se guardan al menos 2 años (recomendación SEIMC).

• Cualquier incidencia se registra junto con las acciones correctoras.

2. Control de medios de cultivo

Los medios deben asegurar que son estériles, que permiten el crecimiento de los microorganismos buscados y/o inhiben el de otros, y que dan una respuesta bioquímica adecuada.

2.1. Medios preparados en el laboratorio

El control abarca todo el proceso:

1. Medios deshidratados y aditivos: al recibirlos, comprobar la caducidad, anotar la fecha de recepción en el envase y almacenarlos bien; al usarlos, comprobar su conservación, caducidad y que el recipiente esté cerrado.

2. Preparación: según el procedimiento o el fabricante. Perjudican el medio el sobrecalentamiento de los ingredientes, la adición de sangre u otros aditivos termosensibles por encima de 50 ºC y envasar menos cantidad de la recomendada.

3. Identificación de cada placa o tubo: tipo de medio, lote y fecha.

4. Almacenamiento: a temperatura ambiente, a 2-8 ºC o a −20 ºC según el medio; las placas, en bolsas bien cerradas (cerrarlas antes de que las placas se enfríen y gelifiquen las perjudica, igual que alternar temperaturas).

5. Control del medio preparado, antes de usarlo:

• Características físicas: aspecto, color, burbujas, precipitados.

• Esterilidad: se incuba el 5 % de los lotes de 100 o menos placas o tubos, o 10 unidades de los lotes mayores, 48 horas a la temperatura de uso y otras 48 horas a temperatura ambiente.

• Funcionamiento con cepas de referencia: recuperación de un número bajo de los microorganismos más sensibles, inhibición de un número alto de los que deben inhibirse (medios selectivos) y reacciones típicas (diferenciales).

Preparación del inóculo de control (método semicuantitativo, el más usado): suspensión de la cepa al 0,5 McFarland; para propiedades nutritivas se diluye 1/100 y para las selectivas 1/10, y se inoculan 10 µL (en medios líquidos, 10 µL de la suspensión sin diluir). El método cuantitativo (Miles y Misra) siembra gotas de 10 µL de diluciones seriadas en sectores de la placa. Puede ser útil sembrar en paralelo una placa del lote nuevo y otra del antiguo.

Un medio funciona bien cuando muestra suficientes colonias de morfología típica de todas las cepas ensayadas, inhibe lo que debe inhibir y da las reacciones típicas.

2.2. Medios comerciales

• Preferiblemente de fabricantes certificados (ISO 9000), que aporten con cada lote: número de lote, caducidad, condiciones de conservación, controles de esterilidad y de crecimiento/inhibición con las cepas usadas y criterios de aceptación.

• Al recibirlos se comprueban siempre las características físicas (color, precipitados, placas rotas, burbujas, colonias).

• Medios exentos: no requieren que el laboratorio repita el control de esterilidad y funcionamiento si el fabricante aporta las especificaciones (por ejemplo, agar sangre, MacConkey, XLD, Hektoen, manitol sal, Sabouraud, caldo selenito, caldo BHI o TSB, según la SEIMC, que se basa en el documento CLSI M22-A3).

• Medios no exentos: el usuario debe comprobar esterilidad y funcionamiento en cada lote (Mueller-Hinton, medios selectivos de Neisseria y de Campylobacter, entre otros), igual que cualquier medio que muestre deficiencias.

• Los defectos se documentan y se notifican al fabricante.

En el ámbito de los alimentos y el agua, ENAC cita la norma UNE-EN ISO 11133 sobre preparación, producción, conservación y ensayos de rendimiento de los medios de cultivo.

2.3. Reactivos y colorantes

Cada reactivo tiene una ficha (componentes, uso, controles, criterios de aceptación, frecuencia, conservación) y se etiqueta con contenido, concentración, conservación, fecha de preparación y caducidad. Se controla con cepas de referencia que den al menos una reacción positiva y otra negativa. Frecuencias orientativas (SEIMC): colorante de Gram, nuevo lote y semanal; ácido-alcohol resistencia, tinciones fluorescentes, catalasa, oxidasa y coagulasa, nuevo lote y cada día de uso; antisueros, nuevo vial y una vez al mes de uso.

3. Control de técnicas

3.1. Validación y verificación del método

Antes de usarlo, el laboratorio debe demostrar que el método funciona en sus manos. ENAC pide confirmar en los métodos cuantitativos la recuperación (con muestras inoculadas, materiales o cepas de referencia o intercomparaciones) y la reproducibilidad a distintos niveles de contaminación; y en los cualitativos, el límite de detección con inóculos de nivel bajo. En la cadena alimentaria se sigue la norma UNE-EN ISO 16140-3 (verificación de la implementación y de las matrices); los métodos desarrollados por el propio laboratorio se validan (por ejemplo, según ISO 16140-4).

3.2. Control interno de cada ensayo

Según ENAC:

• Control de las condiciones de trabajo: informa sobre la esterilidad de medios y materiales auxiliares y sobre la buena práctica del ensayo; con criterios de desviación permitida.

• Ensayos cuantitativos: control de la precisión (muestras naturales sin inocular y/o inoculadas) y de la recuperación.

• Ensayos cualitativos: control a niveles bajos de contaminación.

• En lo posible, con muestras naturales positivas y negativas.

• Herramientas habituales: siembra por duplicado de placas, verificación del factor de dilución, muestras blancas, control de medios, controles ambientales y cualificación del personal.

La periodicidad depende de la robustez del método, de la frecuencia con que se hace y de los resultados históricos. La incertidumbre se estima en los métodos cuantitativos (ISO 29201 en aguas; ISO/TS 19036 en alimentos), pero no en los cualitativos ni en el NMP.

3.3. Control externo: intercomparaciones

• Permiten evaluar el sesgo y demostrar que el laboratorio se mantiene dentro de los criterios de aceptación.

• Las muestras del programa se analizan como si fueran muestras de rutina, con las mismas técnicas y el personal habitual.

• Si el resultado no es satisfactorio: revisar los datos primarios y los controles (medios, temperatura de estufas), hacer un control interno si no se encuentra la causa y evaluar el efecto en las muestras analizadas desde entonces; todo queda documentado.

4. Utilización de materiales de referencia

4.1. Cepas de referencia

Microorganismos de cultivo puro, definidos al menos hasta género y especie, catalogados y preferiblemente de origen conocido. Sirven para verificar y validar medios, reactivos, colorantes y métodos.

• Obtención (con trazabilidad documentada): preferiblemente de una colección reconocida (CECT, ATCC, NCTC…), conservando su certificado; alternativamente, del Programa de Control de Calidad de la SEIMC; excepcionalmente, aislamientos clínicos verificados por al menos tres laboratorios, válidos solo en el de origen.

• Esquema: cepa de referencia → reconstitución → un solo subcultivo → cepas de reserva (liofilización, nitrógeno líquido o ultracongelación; en caldo de soja tripticasa con glicerol al 10-15 % se conservan indefinidamente a −70 ºC y un año entre −50 y −70 ºC; nunca por encima de −50 ºC) → descongelación → cepas de trabajo (en medio sólido a 2-8 ºC o temperatura ambiente, un mes como máximo, hasta 3 subcultivos si se demuestra que no cambian).

• Las cepas de reserva descongeladas no se vuelven a congelar; se congelan viales suficientes para al menos un año (o viales con perlas).

• En cada uso se comprueba pureza y morfología típica. ENAC añade que la primera siembra tras reconstituir es una activación, no un pase, y que en cada pase se evalúan viabilidad y pureza.

• Ejemplo de uso: en la prueba de la coagulasa, Staphylococcus aureus ATCC 25923 (control positivo) y S. epidermidis ATCC 12228 (negativo).

4.2. Otros materiales de referencia

Los materiales de referencia, como secuencias genéticas y sueros, proporcionan trazabilidad, demuestran la precisión de los resultados y sirven para calibrar equipos, validar métodos y comparar métodos como patrones. Se obtienen de colecciones reconocidas (con certificado) o del programa de la SEIMC, se registran a su llegada y se reparten en alícuotas de trabajo listas para usar, conservadas a la temperatura definida.

5. Control de equipos

Requisitos generales: inventario actualizado; identificación única de cada equipo y de su estado de calibración (etiqueta con fecha y validez); ficha con fabricante, número de serie, fechas, ubicación, programa de mantenimiento, calibración y verificación, y registro de actividades. Se calibran los equipos con efecto directo sobre los resultados, con trazabilidad a patrones nacionales o internacionales y certificados que indiquen la incertidumbre (por laboratorios acreditados por ENAC u otros firmantes de los acuerdos EA o ILAC). Un equipo no conforme se etiqueta como «EQUIPO NO CONFORME» o se retira.

Recomendaciones orientativas recogidas por la SEIMC a partir de la guía de ENAC:

Mantenimiento: limpieza, inspección de daños, comprobación general y, si procede, esterilización, con registro de qué se hizo, cuándo y quién. Ejemplos de la guía: incubadores, limpiar y desinfectar el interior mensualmente; baños maría, vaciar, limpiar, desinfectar y rellenar mensualmente (o cada 6 meses si se usa biocida); centrífugas, limpiar y desinfectar en cada uso y revisar anualmente; autoclaves, revisión completa y control de seguridad del vaso de presión anuales; jarras de anaerobiosis, limpiar y desinfectar tras cada uso.

Fuentes: SEIMC, GEGMIC, Recomendaciones generales para el control de calidad interno en Microbiología Clínica (CCI-SEIMC-00 a 04), 2004 (https://seimc.org/wp-content/uploads/2025/05/gegmic_dyc1_2004-1.pdf); SEIMC, Procedimiento n.º 32, Recomendaciones para la implantación de la norma ISO 15189 en el laboratorio de Microbiología Clínica, 2009 (https://seimc.org/wp-content/uploads/2025/06/seimc-procedimientomicrobiologia32.pdf), y n.º 37, PNT-ID-01 (https://seimc.org/wp-content/uploads/2025/06/seimc-procedimientomicrobiologia37.pdf); ENAC, CEA-ENAC-20 Rev. 2, Criterios específicos de acreditación. Análisis microbiológico, septiembre de 2023 (https://www.enac.es/documents/7020/5bdcf1e4-5598-4194-a076-125690f60654). Consultadas el 07/10/2026.