Técnicas de identificación de bacterias: morfológicas, serológicas, bioquímicas y genéticas

Identificar una bacteria es asignarla a un taxón (género y especie) según una clasificación dada. Hoy se hace sobre todo con métodos fenotípicos («tradicionales»), basados en las características observables (morfología, desarrollo, propiedades bioquímicas y metabólicas), por ser más asequibles; los métodos genotípicos suelen reservarse para las bacterias que no se pueden identificar así. Ningún método fenotípico da certeza absoluta: indica a qué género o especie es más probable que pertenezca la bacteria.

1. Esquema general de identificación

1. Partir de un cultivo puro, subcultivando una colonia bien aislada.

2. Pruebas primarias, rápidas y sencillas, que sitúan la bacteria en un grupo y orientan el género: Gram y morfología, catalasa, oxidasa, oxidación-fermentación, fermentación de glucosa, esporas, crecimiento en aerobiosis y anaerobiosis y movilidad.

3. Pruebas secundarias y terciarias para llegar a la especie (pigmentos, indol, coagulasa, fenilalanina-desaminasa…), una a una en varios pasos o en baterías simultáneas.

4. Comparación con perfiles estandarizados o numéricos. La fiabilidad es directamente proporcional al número de características coincidentes con las de los cultivos tipo.

Un error en las pruebas primarias puede conducir a una identificación equivocada.

2. Técnicas morfológicas

2.1. Características microscópicas

El estudio en fresco y tras tinción revela la forma, la agrupación, la estructura y el tamaño de las células. Las tinciones son el primer paso (a veces el único) de la identificación; las más usadas son la de azul de metileno y la de Gram. Términos que se emplean (SEIMC):

2.2. Características macroscópicas (colonias)

• Conviene examinar colonias de cultivos frescos en medios no selectivos, a partir de un cultivo puro.

• Se describen por su tamaño (bastante uniforme dentro de una especie: las de estreptococos son más pequeñas que las de estafilococos y enterobacterias), forma (bordes lisos o irregulares; colonia abultada o plana), consistencia (seca o viscosa; superficie lisa o granular) y color: Pseudomonas aeruginosa produce pigmento verde y Serratia marcescens, rojo; las colonias de S. aureus son doradas.

• Hemólisis en agar sangre: beta (zona clara) o alfa (halo verdoso).

2.3. Características de cultivo

Necesidad de al menos 18-24 horas para ver crecimiento; requisitos de atmósfera, temperatura y nutrición; crecimiento en medios selectivos, diferenciales y cromogénicos (en estos últimos, la hidrólisis de un sustrato por una enzima da color a la colonia, y la identificación presuntiva puede ser tan específica que haga innecesarias otras pruebas).

3. Técnicas bioquímicas

Determinan las características metabólicas. Unas detectan enzimas preformadas y se leen en segundos u horas; otras requieren crecimiento e incubación previa de 18 a 48 horas.

3.1. Pruebas de lectura inmediata

3.2. Pruebas rápidas (menos de 6 horas)

• Hidrólisis del hipurato (hipuricasa; revelado con ninhidrina): Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, Streptococcus agalactiae.

• β-galactosidasa (ONPG): el sustrato incoloro se transforma en ortonitrofenol amarillo; positiva en los fermentadores lentos de la lactosa.

• PYR y LAP (aminopeptidasas): cocos grampositivos.

• Ureasa: desdobla la urea liberando amoniaco, que alcaliniza el medio y vira el indicador a rosa intenso; característica de Proteus.

• Indol: degradación del triptófano por la triptofanasa; con el reactivo de Kovacs aparece un anillo rosa en la superficie del caldo.

3.3. Pruebas lentas (18-48 horas)

Coagulasa: en porta, aglutinación visible en 10 segundos = positiva; en tubo, formación de coágulo incubando a 35 ± 2 ºC con lecturas cada hora durante 4 horas (no más de 4 horas a 35 ºC, porque la fibrinolisina de S. aureus puede lisar el coágulo). Controles: S. aureus ATCC 25923 (positivo) y S. epidermidis ATCC 12228 (negativo).

3.4. Pruebas de resistencia a sustancias

Optoquina, bacitracina, solubilidad en bilis y crecimiento en caldo hipersalino.

3.5. Sistemas comerciales multipruebas

• Galerías manuales: celdillas con sustrato liofilizado que permiten 10-50 pruebas a la vez. Los resultados se agrupan de tres en tres: prueba negativa = 0; primera positiva = 1; segunda = 2; tercera = 4. La suma da un dígito de 0 a 7, y el conjunto, un código numérico que identifica la especie. Ejemplos: API, Enterotube. Según la Universidad de Salamanca, el API para gramnegativos permite 23 pruebas a partir de una sola colonia, y el Enterotube tiene 12 compartimentos que detectan 15 características.

• Sistemas automatizados: inoculación, incubación y lectura automáticas; algunos paneles incluyen antimicrobianos y hacen a la vez identificación y antibiograma (MicroScan, Vitek, Phoenix…).

• Todos exigen condiciones precisas de inóculo, inoculación, incubación y lectura; si no, dan errores.

4. Técnicas serológicas

Se basan en la reacción antígeno-anticuerpo con antisueros específicos. Se usan para identificar con más rapidez o cuando las pruebas bioquímicas no son concluyentes.

• Antígenos bacterianos: capsulares (K), somáticos (O), que corresponden al lipopolisacárido de la pared de las gramnegativas, y flagelares (H). Los antisueros se designan con esas letras y el número del antígeno.

• Primero se usan sueros polivalentes; la caracterización (serotipado) se hace con sueros monovalentes. Hay antisueros comerciales para Salmonella, Shigella, E. coli o Haemophilus, entre otros.

• Los antiguos antisueros policlonales daban reacciones cruzadas; hoy se usan monoclonales, más puros y fiables.

• Ejemplo práctico (aglutinación en porta): una gota de antisuero O polivalente de Salmonella se emulsiona con colonias de cultivo puro; la aglutinación sobre fondo oscuro es positiva, y la cepa se envía a un centro de referencia para su serotipado completo (Universidad de La Rioja).

• Los métodos inmunológicos permiten también detectar antígenos directamente en la muestra, sin cultivo, cuando el microorganismo no se puede cultivar o su cultivo es peligroso.

5. Técnicas genéticas (moleculares)

5.1. Por qué

Los sistemas fenotípicos tienen problemas inherentes: no todas las cepas de una especie son homogéneas, una cepa puede dar patrones distintos en ensayos repetidos y las bases de datos son limitadas. Los métodos moleculares son complementarios, alternativos o incluso de referencia. Su coste y especialización hacen que suelan centralizarse en laboratorios de referencia.

5.2. Diana más usada: el ARNr 16S

El análisis de la secuencia del gen del ARN ribosómico 16S es la herramienta más utilizada en taxonomía bacteriana: está presente en todas las bacterias, su función no cambia con el tiempo, es un buen marcador de evolución y tiene un tamaño adecuado. Otras dianas: ARNr 16S-23S y 23S, rpoB y gyrB.

5.3. Etapas

1. Extracción del ADN cromosómico, del cultivo o directamente de la muestra.

2. Amplificación por PCR en un termociclador de un fragmento del ARNr 16S de 500-1.500 pb, con cebadores dirigidos a regiones conservadas (ninguno es totalmente universal).

3. Comprobación del amplicón por electroforesis en gel de agarosa.

4. Secuenciación del amplicón.

5. Comparación con bases de datos (por ejemplo, BLAST de GenBank).

5.4. Interpretación

• Una actitud de consenso acepta que una similitud ≥ 98,5 % define una especie y del ≥ 95 % al 99 %, un género, aunque estos umbrales no sirven para todos los géneros.

• Limitaciones: secuencias de calidad deficiente o mal asignadas en las bases de datos; baja correlación con el fenotipo (E. coli y Shigella dysenteriae, o Streptococcus pneumoniae y S. mitis, tienen secuencias muy parecidas); baja resolución del 16S en algunos grupos; electroferogramas mixtos. Si fenotipo y genotipo discrepan, ambos se estudian de nuevo.

5.5. Otros métodos: proteómica (MALDI-TOF)

La espectrometría de masas MALDI-TOF (desorción/ionización por láser asistida por matriz y analizador de tiempo de vuelo) identifica por el espectro de masas de las proteínas del microorganismo. Da resultados fiables en menos de un minuto por muestra con bajo coste de reactivos, pero exige cultivos puros y recientes (no más de 18-24 horas) y calibraciones y controles frecuentes.

6. Comparación

Fuentes: SEIMC, Procedimiento en Microbiología Clínica n.º 37, Métodos de identificación bacteriana en el laboratorio de microbiología, 2010, y su PNT-ID-01 (https://seimc.org/wp-content/uploads/2025/06/seimc-procedimientomicrobiologia37.pdf); Universidad de Salamanca, curso «Microbiología de los ecosistemas acuáticos», capítulo 7 Técnicas básicas de identificación bacteriana (http://aulacidta5.usal.es/aulavirtual/Demos/microbiologia/unidades/curso/UNI_02/u2c7s1.htm, u2c7s2.htm y u2c7s3.htm); Universidad Miguel Hernández, Prácticas de Microbiología: Identificación bacteriana (catalasa, oxidasa, indol, O/F, nitratos, ureasa, citrato, acidificación de hidratos de carbono, producción de sulfhídrico y de pigmentos) e Identificación por biología molecular (https://sites.google.com/a/goumh.umh.es/practicas-de-microbiologia/indice/identificacion-bacteriana); Universidad de La Rioja, S. A. Sanz Cervera, Prácticas de Microbiología, 2.ª ed., 2011, Confirmación serológica de Salmonella (https://dialnet.unirioja.es/descarga/libro/100835.pdf). Consultadas el 07/10/2026.