Examen microscópico de las bacterias: observación en fresco, métodos de tinción y principales tinciones bacterianas

El microscopio es una herramienta de gran importancia para observar e identificar microorganismos. Hay que distinguir entre las técnicas que observan microorganismos vivos (preparaciones en fresco) y las preparaciones teñidas, que aportan información adicional sobre la pared celular o sobre estructuras especiales como las esporas. Este artículo describe ambas y las tinciones bacterianas más usadas.

1. Examen microscópico: consideraciones generales

• Casi todos los microorganismos necesitan una preparación especial antes de examinarlos al microscopio óptico, porque tienen poco contraste natural.

• Una preparación se observa centrándola en la platina y enfocando primero con el objetivo de 10x, después con el de 40x y finalmente con el de inmersión. Para ver bacterias se usa el objetivo de inmersión (100x) con una gota de aceite.

• En el examen se anotan la forma (cocos, bacilos), el tamaño, la agrupación y, en preparaciones teñidas, la reacción a la tinción (por ejemplo, grampositivo o gramnegativo).

2. Observación en fresco

2.1. Técnicas

Desde un cultivo: si es líquido, se deposita una gota con el asa (cargándola 2 o 3 veces si recoge poco) y se cubre evitando burbujas; si es sólido, primero se pone una gota de agua en el portaobjetos y en ella se resuspende una pequeña cantidad de una colonia.

2.2. Utilidad y limitaciones

• Permite observar microorganismos vivos: su morfología y su movilidad. Se ha usado, por ejemplo, para buscar el protozoo móvil Trichomonas vaginalis.

• Su inconveniente es el poco contraste: con el microscopio de campo claro su uso es limitado. Para observar microorganismos vivos se usan con frecuencia los microscopios de contraste de fases o de campo oscuro.

• Algunos colorantes, llamados vitales, pueden añadirse a una preparación en fresco a concentraciones que no matan las células.

• La tinción negativa con tinta china o nigrosina se hace también sobre una preparación en fresco (ver apartado 4.5).

3. Métodos de tinción

3.1. Preparación del frotis y fijación

1. Frotis: desde un cultivo líquido, una gota extendida en capa fina sobre un portaobjetos limpio; desde un cultivo sólido, una pequeña cantidad de colonia resuspendida en una gota de agua.

2. Secado: al aire o acercándolo a la llama sin calentarlo en exceso.

3. Fijación por calor: se pasa el portaobjetos 3-4 veces por la llama del mechero (la llama toca la cara inferior). El calor mata las células por desnaturalización de sus proteínas, que quedan adheridas al portaobjetos.

4. Fijación química, para especímenes delicados: ácido ósmico, formaldehído o glutaraldehído; es menos lesiva que el calor.

La fijación tiene inconvenientes: puede distorsionar la apariencia de las células y no permite ver su movimiento.

3.2. Colorantes y mordientes

• Casi todos los colorantes son sales. En los básicos, el ion que tiñe es positivo; son los más usados porque la superficie de las bacterias tiene carga débilmente negativa (safranina, fucsina básica, cristal violeta, azul de metileno). Los ácidos (eosina, fucsina ácida, rojo Congo) se unen a las partes cargadas positivamente y se usan para teñir tejidos.

• Los mordientes no son colorantes: aumentan la afinidad de la célula por el colorante (el lugol, compuesto de yodo, en la tinción de Gram) o engrosan estructuras finas como los flagelos.

3.3. Tipos de tinción

4. Principales tinciones bacterianas

4.1. Tinción simple

Se tiñe con un colorante básico (azul de metileno, cristal violeta o fucsina básica) durante unos 5 minutos y se aclara brevemente con agua: se tiñen casi todas las bacterias.

4.2. Tinción de Gram

Diseñada en 1884 por el bacteriólogo danés Christian Gram, clasifica las bacterias en grampositivas y gramnegativas. El resultado depende de la estructura de la pared: las gramnegativas tienen una capa delgada de peptidoglicano y una membrana externa; las grampositivas, una capa gruesa de peptidoglicano y carecen de membrana externa.

Entre los pasos se lava con agua; al final se seca. Resultado: grampositivas violeta, gramnegativas rosa o rojo.

Detalles prácticos (Universidad de La Rioja): usar cultivos jóvenes (12 a 18 horas en las bacterias más comunes), en fase exponencial, porque las grampositivas en fases tardías dan resultados irregulares; el decolorante se gotea hasta que no arrastre más cristal violeta; hace falta un enfoque exacto, porque el violeta puede parecer rojo en los bordes de la célula.

4.3. Tinción de ácido-alcohol resistencia (Ziehl-Neelsen)

Distingue las micobacterias (géneros Mycobacterium y Nocardia, según la Universidad de Salamanca), cuya pared contiene ácidos micólicos de naturaleza cérea: resisten no solo la decoloración con alcohol, sino también con una mezcla de ácido y alcohol. Procedimiento según la SEIMC:

1. Cubrir el frotis con fucsina fenicada (carbolfucsina) filtrada.

2. Calentar suavemente, flameando varias veces, hasta la emisión de vapores (unos 10 segundos), sin desecar ni hervir; esperar 5 minutos.

3. Lavar y decolorar con alcohol-clorhídrico durante 2 minutos.

4. Lavar y teñir con azul de metileno durante 3 minutos.

5. Observar con el objetivo de inmersión: los bacilos ácido-alcohol resistentes (BAAR) aparecen rojo brillante sobre fondo azul. Antes de dar una tinción por negativa se examinan al menos 300 campos.

Variantes: la tinción de Kinyoun o coloración fría usa sustancias tensoactivas y no se calienta; las tinciones con fluorocromos (auramina O, auramina-rodamina) muestran los BAAR fluorescentes amarillos o naranjas bajo luz ultravioleta y se pueden leer con menos aumento (×250), por lo que son el método de cribado cuando hay muchas muestras; ante cualquier duda se confirman con Ziehl-Neelsen. Otros microorganismos tienen grados de ácido-alcohol resistencia: Nocardia, Rhodococcus, Legionella micdadei y los ooquistes de Cryptosporidium, entre otros.

4.4. Tinción de esporas

Las endosporas de géneros como Bacillus y Clostridium resisten el calor, la sequedad, la irradiación y los agentes químicos; su tinción exige procedimientos drásticos y, una vez teñidas, apenas se decoloran. Una tinción de Gram puede revelarlas «en negativo» cuando aún están dentro de la célula, pero no cuando están libres.

Tinción de Wirtz-Conklin:

1. Cubrir el frotis fijado con verde malaquita y calentar hasta la emisión de vapores, sin hervir, manteniéndolo unos minutos (3 minutos en el protocolo de la UMH; 5 minutos, con calentamiento intermitente, en el de la Universidad de La Rioja) y sin dejar que se seque.

2. Lavar con agua (las células vegetativas se decoloran; las esporas retienen el verde).

3. Contrastar con safranina (0,5-1 minuto) y lavar.

Resultado: esporas verdes; células vegetativas rosas o rojas.

4.5. Tinción de cápsulas (tinción negativa)

La mejor técnica para ver cápsulas es una tinción negativa con tinta china o nigrosina: el colorante no penetra en la cápsula y ennegrece el fondo, de modo que la cápsula se ve como una zona clara alrededor de la célula. En ocasiones se usa después un colorante para resaltar las células.

4.6. Tinción de flagelos

La tinción de Leifson usa rosanilina con ácido tánico como mordiente, que engruesa los flagelos para hacerlos visibles. Exige fijar las células con formol y trabajar con mucho cuidado.

4.7. Tinciones para hongos

• Azul de lactofenol (azul algodón): tinción convencional para ver la morfología y la gemación de las células; también para teñir microcultivos de hongos filamentosos.

• Tinta china: mismo procedimiento, con las células resuspendidas en tinta.

4.8. Control de calidad de los colorantes

La SEIMC recomienda controlar los colorantes con cepas de referencia que den una reacción positiva y otra negativa: el de Gram, con cada nuevo lote y semanalmente; los de ácido-alcohol resistencia y las tinciones fluorescentes, con cada nuevo lote y cada día de uso; el azul de lactofenol, con cada nuevo lote o cuando se prepare.

5. Resumen

Fuentes: Universidad de Salamanca, curso «Microbiología de los ecosistemas acuáticos», capítulo 1 Observación de microorganismos (http://aulacidta5.usal.es/aulavirtual/Demos/microbiologia/unidades/curso/UNI_02/u2c1s3.htm) y capítulo 3 «Métodos de estudio de los microorganismos» (http://aulacidta5.usal.es/aulavirtual/Demos/microbiologia/unidades/documen/uni_02/56/cap304.htm, cap305.htm y cap306.htm); Universidad Miguel Hernández, Prácticas de Microbiología: Observación microscópica, Observación en fresco, Fijación al calor, Tinción de Gram, Tinción de esporas, Tinciones para hongos (https://sites.google.com/a/goumh.umh.es/practicas-de-microbiologia/indice/observacion-microscopica); Universidad de La Rioja, S. A. Sanz Cervera, Prácticas de Microbiología, 2.ª ed., 2011 (https://dialnet.unirioja.es/descarga/libro/100835.pdf); SEIMC, Procedimiento n.º 9a, Micobacterias, PNT de tinción de Ziehl-Neelsen (https://seimc.org/wp-content/uploads/2025/06/seimc-procedimientomicrobiologia9a.pdf), y n.º 32, Tabla 1 (https://seimc.org/wp-content/uploads/2025/06/seimc-procedimientomicrobiologia32.pdf). Consultadas el 07/10/2026.