Técnicas de recuento de microorganismos mediante cultivo: concentración, dilución y número más probable

Contar los microorganismos de una muestra es una de las determinaciones más usadas en microbiología: muchos valores paramétricos del agua de consumo y muchos criterios microbiológicos de los alimentos se expresan como recuentos. Los métodos por cultivo cuentan solo los microorganismos viables, es decir, capaces de reproducirse. Para que el recuento sea posible, la muestra se concentra si tiene muy pocos microorganismos o se diluye si tiene demasiados; cuando no se pueden contar colonias se recurre al número más probable (NMP).

1. Tipos de recuento

Los recuentos de viables por cultivo son de dos clases: en placa (se cuentan colonias) y en tubo (técnica del NMP).

2. Recuento en placa

2.1. Fundamento

Se hacen diluciones sucesivas de la muestra en condiciones de esterilidad y se siembran cantidades conocidas en placas. Alguna dilución dará colonias separadas que se pueden contar; conociendo el número de colonias, la cantidad sembrada y la dilución, se calcula el número de viables de la muestra original.

Como una colonia puede proceder de una sola célula o de un grupo, el resultado se expresa en unidades formadoras de colonias (UFC). Se consideran condiciones óptimas de recuento las placas con entre 30 y 300 colonias (menos si se trata de hongos, cuyas colonias son mayores): así todas las células disponen de nutrientes y los errores del método son menores. ENAC remite a las normas ISO 8199 (agua) e ISO 7218 (alimentos) para el intervalo de recuento de las placas.

2.2. Siembra en masa (en profundidad)

1. Se deposita 1 mL de la muestra o de cada dilución en placas estériles vacías.

2. Se añaden 15-20 mL del medio fundido y mantenido a unos 47 ºC.

3. Se mezcla moviendo la placa tapada sobre la mesa con movimientos circulares y de vaivén, sin levantarla.

4. Se deja solidificar (al menos media hora) y se incuba.

5. Se eligen las dos placas de la dilución que tenga 30-300 colonias y se cuentan con un cuentacolonias, con la placa boca abajo y dividida en sectores si hace falta.

Cálculo: UFC/mL (o /g) = media de colonias de las placas elegidas × factor de dilución (inverso de la dilución sembrada).

En alimentos, el tiempo entre depositar la muestra y verter el medio no debe superar los 10 minutos; los aerobios mesófilos se incuban, por ejemplo, en agar para recuento en placa (PCA) a 31 ºC durante 72 horas (Universidad de La Rioja).

2.3. Siembra en superficie

1. Placas con el medio ya solidificado (unos 15 mL).

2. Se depositan 0,1 mL de la muestra o de cada dilución y se extienden con un asa de Drigalski estéril.

3. Se dejan secar 2-3 minutos y se incuban.

4. Se cuentan las dos placas de la dilución con 30-300 colonias.

Cálculo: UFC/mL = media de colonias × factor de dilución × 10 (porque se sembró 0,1 mL y no 1 mL).

2.4. Recuento por filtración en membrana

Se hace pasar un volumen conocido de agua (por ejemplo, 100 mL) por una membrana estéril de 0,45 µm, que retiene las bacterias; la membrana se coloca sobre un medio de cultivo (por difusión, los nutrientes llegan a las bacterias, que crecen sobre ella) y, tras la incubación, se cuentan las colonias. A partir del volumen filtrado se calcula el resultado en UFC/100 mL. Es el método de los recuentos de E. coli, coliformes, enterococos y Clostridium perfringens en agua de consumo (ver el tema de análisis del agua). Si la muestra es muy turbia, la filtración no es correcta y el recuento no es real.

3. Concentración

Cuando el microorganismo buscado está en número muy bajo, la muestra se concentra antes de sembrarla:

• Filtración: es a la vez concentración y siembra cuando la membrana se incuba directamente sobre el medio. En el método SEIMC para Legionella en agua, la concentración se hace por filtración en aguas limpias y por centrifugación en aguas con elevada turbidez; se usan filtros de 0,45 µm y 47 mm de diámetro. Si se sospecha mucha flora acompañante, el filtro se pasa a un frasco con 5-25 mL de diluyente y se agita vigorosamente al menos 2 minutos para resuspender las bacterias; si la membrana se colmata rápidamente, se concentra por centrifugación.

• Centrifugación: en ese mismo método se centrifuga 1 L de muestra a 6.000 ×g durante 10 minutos (o 3.000 ×g durante 30 minutos) entre 15 y 25 ºC, se elimina el sobrenadante y el depósito se resuspende en 2-20 mL de diluyente, anotando el volumen. Los concentrados se analizan de inmediato o se guardan a 2-6 ºC, en oscuridad, no más de 14 días.

• El resultado se refiere siempre al volumen original: por eso hay que registrar el volumen filtrado o el de resuspensión.

4. Dilución

4.1. Diluciones decimales

Se usan cuando la muestra tiene demasiados microorganismos para contarlos. Cada dilución contiene la décima parte de muestra que la anterior:

1. Se reparten 9 mL de diluyente estéril (suero salino o agua de peptona) en tubos.

2. Se transfiere 1 mL de la muestra al primer tubo: dilución 1/10 (10⁻¹).

3. Se agita bien y, con una pipeta nueva, se pasa 1 mL al segundo tubo: 1/100 (10⁻²); y así sucesivamente.

4. Al denominador de estas fracciones se le llama factor de dilución.

Con una sola pipeta se pueden sembrar todas las diluciones si se empieza por la más diluida.

4.2. Suspensión inicial de muestras sólidas

En alimentos se pesan asépticamente 25 g y se añaden 225 mL de agua de peptona al 0,1 %; se homogeneiza (por ejemplo, en un Stomacher) y se obtiene la suspensión madre, que es la dilución 1:10. En alimentos líquidos (leche, zumo) la suspensión madre es el propio alimento. La preparación de la suspensión inicial y de las diluciones decimales se rige por la serie de normas UNE-EN ISO 6887 (citadas por ENAC).

5. Número más probable (NMP)

5.1. Fundamento

El NMP (también recuento en tubo) se basa en la presencia o ausencia del microorganismo en volúmenes decrecientes de muestra, sembrados en paralelo en series de 3 o de 5 tubos de medio líquido. Tras la incubación se cuentan los tubos positivos: cada uno indica que en esa cantidad había al menos un microorganismo. La interpretación se basa en una distribución de Poisson y se hace con tablas del NMP. Se usa sobre todo cuando se esperan recuentos bajos; la FDA lo considera especialmente útil para concentraciones bajas (menos de 100/g), en leche y agua, y en alimentos cuyas partículas impiden contar colonias.

Supuestos del método (FDA): las bacterias están distribuidas al azar en la muestra, separadas y sin agruparse; todo tubo que reciba un solo organismo viable mostrará crecimiento; y los tubos son independientes. El NMP es el valor de concentración que hace más probable el resultado observado.

5.2. Procedimiento (agua, 3 series de 3 tubos)

1. Tres series de tres tubos, con unos 10 mL del caldo adecuado cada uno.

2. Primera serie: 10 mL de muestra por tubo (en medio a doble concentración); segunda: 1 mL; tercera: 0,1 mL.

3. Incubación a la temperatura y durante el tiempo propios del microorganismo.

4. Lectura: la positividad se manifiesta según el caso como turbidez, viraje de un indicador o formación de gas (por ejemplo, gas en la campana de Durham en el recuento de coliformes).

5. Con el número de tubos positivos de cada serie se busca el resultado en la tabla y se expresa como NMP/100 mL (en alimentos, NMP/g o /mL).

En alimentos se siembra 1 mL de las diluciones 1:10, 1:100 y 1:1.000 en cada serie de tres tubos.

5.3. Lectura de las tablas

Las tablas se calculan para unas cantidades concretas de inóculo y hay que convertir el resultado si las cantidades sembradas son otras. Ejemplo de la tabla de la FDA para tres tubos con 0,1, 0,01 y 0,001 g de muestra: el resultado 3-1-0 (tres, uno y ningún tubo positivo) corresponde a 43 NMP/g; si los inóculos hubieran sido diez veces menores (0,01, 0,001 y 0,0001 g), se multiplica por 10: 430/g.

• Cada valor de la tabla va acompañado de su intervalo de confianza del 95 %, que es amplio: el NMP es una estimación estadística.

• Si todos los tubos son positivos, la tabla no da límite superior (se expresa como «mayor que»); si todos son negativos, «menor que».

• Si la combinación obtenida no figura en las tablas, es un resultado improbable: puede indicar un error de laboratorio o una interferencia, y lo más fiable es repetir el ensayo.

• Según ENAC, la estimación de la incertidumbre no se aplica a los métodos cualitativos ni al NMP.

5.4. Variante: sustrato definido en bandejas multipocillo

El Ministerio de Sanidad tiene autorizado para agua de consumo un método NMP con tecnología de sustrato definido en bandejas de 51 pocillos: se añade una dosis de sustrato a 100 mL de muestra, se reparte y sella en la bandeja y se incuba 18-22 horas a 36 ± 2 ºC; los pocillos amarillos son positivos para coliformes y los amarillos con fluorescencia azulada bajo luz UV de 365 nm, para E. coli. El resultado se lee en la tabla NMP de la bandeja y se expresa en NMP/100 mL.

6. Placa o NMP

La Universidad Miguel Hernández señala que la filtración por membrana permite discriminar las aguas aptas y no aptas de forma más rápida, económica y sencilla que el NMP. El Real Decreto 3/2023 expresa los valores paramétricos de E. coli, enterococo intestinal y bacterias coliformes en «UFC o NMP en 100 ml», según el método empleado.

Fuentes: Universidad de Salamanca, curso «Microbiología de los ecosistemas acuáticos», capítulo 6 Métodos de recuento y determinación de viables (http://aulacidta5.usal.es/aulavirtual/Demos/microbiologia/unidades/curso/UNI_02/u2c6s1.htm y siguientes); Universidad de La Rioja, S. A. Sanz Cervera, Prácticas de Microbiología, 2.ª ed., 2011 (https://dialnet.unirioja.es/descarga/libro/100835.pdf); Universidad Miguel Hernández, Prácticas de Microbiología: Análisis microbiológico del agua (https://sites.google.com/a/goumh.umh.es/practicas-de-microbiologia/indice/analisis-microbiologico-del-agua); SEIMC, Procedimiento n.º 20, Diagnóstico microbiológico y control de la legionelosis, PNT-LP-02 (https://seimc.org/wp-content/uploads/2025/06/seimc-procedimientomicrobiologia20.pdf); ENAC, CEA-ENAC-20 Rev. 2, 2023 (https://www.enac.es/documents/7020/5bdcf1e4-5598-4194-a076-125690f60654); U.S. Food and Drug Administration, Bacteriological Analytical Manual, Appendix 2: Most Probable Number from Serial Dilutions, agosto de 2023 (https://www.fda.gov/media/183668/download); Ministerio de Sanidad, Métodos microbiológicos alternativos en agua de consumo, 2023 (https://www.sanidad.gob.es/areas/sanidadAmbiental/calidadAguas/aguasConsumoHumano/publicaciones/docs/2023_METODOS_MICROBIOLOGICOS_ALTERNATIVOS.pdf); Real Decreto 3/2023, anexo I (https://www.boe.es/buscar/act.php?id=BOE-A-2023-628). Consultadas el 07/10/2026.