Medios de cultivo: componentes básicos y preparación. Técnicas de siembra y de aislamiento. Conservación de cepas
Cultivar un microorganismo exige ofrecerle los nutrientes y las condiciones que necesita (el medio de cultivo), inocularlo sin contaminarlo (siembra), separarlo de los demás hasta obtener un cultivo puro (aislamiento) y, si interesa, mantenerlo vivo y estable durante años (conservación de cepas).
1. Medios de cultivo
1.1. Concepto
Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos. También sirve para demostrar características bioquímicas, por ejemplo la producción de ácido y gas al fermentar un hidrato de carbono. Su composición depende de la especie: hay microorganismos poco exigentes y otros muy exigentes que necesitan vitaminas, suero o sangre.
1.2. Componentes básicos
| Componente | Función |
|---|---|
| Agua | Componente indispensable (se usa agua destilada) |
| Peptonas | Obtenidas por digestión enzimática o química de proteínas animales o vegetales; ricas en péptidos y aminoácidos |
| Extractos | De carne (bases orgánicas solubles, vitaminas, minerales) y de levadura (aminoácidos y vitaminas del complejo B) |
| Fluidos corporales | Sangre y plasma: aportan factores de crecimiento a microorganismos exigentes |
| Sistemas amortiguadores | Mantienen el pH; sobre todo fosfatos |
| Indicadores de pH | Ponen de manifiesto propiedades bioquímicas: la fermentación de un azúcar baja el pH y vira el indicador; el uso de urea o de algunos aminoácidos lo sube |
| Agentes reductores | Cisteína, tioglicolato: permiten el desarrollo de microaerófilos y anaerobios |
| Agentes selectivos | Cristal violeta, sales biliares, azida sódica, determinados antibióticos |
| Agar | Agente gelificante: polisacárido obtenido de algas marinas |
La Universidad Miguel Hernández agrupa los componentes en indispensables (agua, nutrientes orgánicos e inorgánicos) y alternativos (sustancias isosmotizantes como el NaCl, agente solidificante, tampones, indicadores de pH).
1.3. Clasificación
Por su estado físico:
| Tipo | Agar | Observación |
|---|---|---|
| Sólidos | Unos 12-15 g/L | Sólidos por debajo de 45 ºC; por encima, líquidos |
| Semisólidos | Unos 3 g/L | — |
| Líquidos (caldos) | Ninguno | — |
Por su uso:
-
Generales: permiten el desarrollo de muchos microorganismos (caldo nutritivo: peptona, extracto de carne, extracto de levadura y cloruro sódico).
-
Enriquecidos: llevan factores de crecimiento especiales como sangre o suero, para microorganismos muy exigentes (agar sangre).
-
Selectivos: permiten el crecimiento de un tipo de microorganismo e inhiben el de otros. Las sales biliares, el cristal violeta o el verde brillante inhiben a las grampositivas (agar MacConkey, eosina-azul de metileno, Endo); otros llevan antibióticos (agar SPS para clostridios sulfito-reductores en aguas). Ningún medio es totalmente selectivo: donde crece Salmonella crecen también otras enterobacterias.
-
Diferenciales: ponen de relieve propiedades que distinguen a un microorganismo de otros que crecen en el mismo medio. En agar sangre se ve la hemólisis: alfa (parcial, verdosa), beta (total, clara) y gamma (ausencia). Con un azúcar y un indicador (lactosa y rojo fenol) se separan fermentadores y no fermentadores.
-
Selectivos y diferenciales a la vez: el agar MacConkey es selectivo por sus sales biliares y diferencial por su lactosa y rojo fenol.
-
De transporte y conservación: no nutritivos, semisólidos; mantienen los microorganismos sin que se multipliquen; suelen llevar glicerol.
Medios para hongos y levaduras: la mayoría son aerobios, crecen a pH ácido y en el laboratorio a 22-25 ºC. Para impedir el crecimiento bacteriano los medios se acidifican (pH en torno a 5) o se les añaden antibióticos; hoy se prefieren los segundos (ejemplos: Sabouraud cloranfenicol o cicloheximida, oxitetraciclina-glucosa agar, rosa de Bengala-cloranfenicol).
1.4. Preparación
-
La mayoría de los medios se comercializan deshidratados: se pesa la cantidad indicada por el fabricante y se disuelve en agua destilada. Los que llevan agar se calientan hasta su completa disolución; los líquidos basta agitarlos.
-
Los caldos se reparten en tubos o matraces sin superar 1/3 del volumen del recipiente; los sólidos fundidos se reparten en tubos o frascos, no en placas.
-
Se esterilizan en autoclave (por ejemplo, 121 ºC durante 15-20 minutos). Las sustancias termolábiles se esterilizan por filtración y se añaden después.
-
Los medios sólidos se vierten en placas de Petri estériles cerca de la llama, o se dejan solidificar inclinados en tubo (slant).
-
Se pueden guardar a temperatura ambiente, pero es preferible a 4 ºC para evitar su deshidratación.
Los medios preparados en el laboratorio deben quedar registrados (identidad, lote o fecha, caducidad, persona) y someterse a control de esterilidad y funcionamiento con cepas de referencia (SEIMC).
2. Técnicas de siembra
2.1. Técnica aséptica
Persigue a la vez no contaminar al operador y no contaminar la muestra. Principios: trabajar junto a una llama; esterilizar el asa al rojo y enfriarla antes de tomar la muestra; flamear las bocas de tubos y matraces al abrirlos y tras inocular; sujetar los tapones en la mano; mantener inclinado el tubo abierto; no dejar nunca la tapa de la placa sobre la mesa.
2.2. Instrumentos y modalidades
| Desde → hacia | Instrumento y técnica |
|---|---|
| Sólido → líquido | Asa de siembra |
| Líquido → líquido | Pipeta estéril (a veces asa) |
| Sólido → sólido (placa) | Asa, normalmente por agotamiento en estría |
| Cultivo en profundidad del agar | Aguja o pincho de siembra |
| A tubo de medio sólido | En profundidad (picadura vertical con aguja) o en superficie inclinada (en zigzag) |
| Líquido → placa | Asa (estría), o pipeta en superficie o en masa |
-
Siembra en superficie: se deposita una cantidad conocida (normalmente 0,1 mL) y se extiende por todo el agar con un asa de Drigalski estéril; se deja secar unos minutos antes de incubar. Es la siembra que se usa siempre para el recuento de hongos y levaduras, porque expone más las células al oxígeno.
-
Siembra en masa (en profundidad): se deposita 1 mL en una placa vacía estéril, se añade el agar fundido a unos 50 ºC, se mezcla con movimientos circulares y de vaivén y se deja solidificar unos 30 minutos.
-
Siembra de anaerobios sencilla: inóculo en agar fundido a 45-50 ºC sin agitar o en caldo, y capa de parafina estéril encima.
-
Siembra combinada en tubo (agar hierro de Kligler): picadura hasta el fondo y estría en la superficie inclinada al retroceder.
3. Técnicas de aislamiento
En la naturaleza los microorganismos viven en comunidades mixtas. Un cultivo puro contiene una sola clase de microorganismo y es el punto de partida para identificarlo o estudiar sus características. Se obtiene inmovilizando las células sobre un medio sólido: cada célula origina una colonia (un clon), que se transfiere a un medio nuevo.
3.1. Agotamiento en estría
Método rápido y simple de agotamiento progresivo y continuo del inóculo sobre la superficie de una placa:
-
Se toma el inóculo con el asa estéril y fría y se extiende en estrías muy juntas en una porción pequeña de la placa, próxima al borde.
-
Se flamea y enfría el asa y se hace una segunda tanda de estrías arrastrando desde la primera, sobre una zona virgen.
-
Se repite con una tercera tanda. En cada tanda se arrastran menos células.
Tras incubar (placa invertida), las últimas estrías dan colonias aisladas. Variantes: siembra en cuadrante y estrías escocesas; en estas, tras cada descarga se flamea el asa y, sin recargarla, se gira la placa unos 45º y se arrastra desde el final de las estrías anteriores, terminando con un pequeño agotamiento en el centro. La pureza de una colonia se comprueba resembrándola por agotamiento en otra placa.
3.2. Diluciones sucesivas
Se hacen diluciones seriadas de la muestra (1 mL en 9 mL de suero salino estéril: 1/10 o 10⁻¹, y así sucesivamente) y se siembran cantidades conocidas en placas, en masa o en superficie. Alguna dilución dará colonias separadas y, además, permite contar los viables. Como una colonia puede proceder de una célula o de un agregado, se habla de unidades formadoras de colonias (UFC).
3.3. Medios selectivos y enriquecimiento
El aislamiento se apoya también en medios selectivos que inhiben la flora acompañante y en enriquecimientos en medio líquido selectivo, que favorecen la multiplicación del microorganismo buscado e inhiben a los competidores (por ejemplo, el caldo selenito para Salmonella).
4. Conservación de cepas
4.1. Objetivos
Según la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), conservar bien una cepa exige tres cosas: que el cultivo sea puro, que sobrevivan al menos el 70-80 % de las células y que permanezcan genéticamente estables. No hay un método de uso general.
4.2. Métodos
| Grupo | Método | Claves |
|---|---|---|
| De elección (largo plazo): se paraliza el crecimiento sin matar las células | Congelación | Suspensión con crioprotector, sobre todo glicerol al 15-20 % (también dimetilsulfóxido, leche descremada, azúcares). Lo mejor: nitrógeno líquido (−195 ºC, según la CECT) o su fase gaseosa (−140 ºC); congeladores que bajen de −70 ºC (no son aconsejables los de −20 a −40 ºC). Criotubos de un solo uso o criobolas. Congelar y descongelar rápido (descongelar a 37 ºC). No sirve para anaerobios como Clostridium si se usan criobolas. |
| Liofilización | Congelación y eliminación del agua por sublimación al vacío (sin superar −50 ºC). Crioprotectores: inositol (bacterias) o leche descremada (hongos y actinomicetos); no glicerol. Concentración de 10⁸-10⁹ células/mL en bacterias. Los liófilos, al vacío y en oscuridad, se guardan a temperatura ambiente (preferentemente 18 ºC, sin bajar de 0 ºC). Muy cómodo para envíos. | |
| Alternativos | Transferencia periódica | Resiembras a medio fresco y almacenamiento a 4-8 ºC; a veces con capa de aceite mineral. Es el peor para la estabilidad genética y facilita contaminaciones. |
| Suspensión en agua destilada (o de mar) estéril | Hasta 10⁴-10⁵ células/mL; buena viabilidad en hongos, levaduras y algunas bacterias. | |
| Restringidos | Desecación en papel de filtro, en suelo, arena o silicagel, en bolitas de alginato o en sal (halobacterias) | Para grupos que no resisten la congelación ni la liofilización. |
Al recuperar una cepa conservada no deben usarse directamente sus células: hay que revitalizarla sembrándola en un medio no selectivo.
4.3. Cepas de referencia en el laboratorio
-
Se obtienen de colecciones reconocidas (CECT, ATCC, NCTC), con certificado; también del programa de control de calidad de la SEIMC o de casas comerciales con certificado de autenticidad.
-
Cepas de reserva: subcultivos de la cepa de referencia, liofilizadas, en nitrógeno líquido o congeladas a ≤ −50 ºC con agentes estabilizantes (por ejemplo, caldo de soja tripticasa con glicerol al 10-15 % v/v, o tubos con 20-30 esferas). Una vez descongeladas no se vuelven a congelar.
-
Cepas de trabajo: subcultivos de la de reserva; a 2-8 ºC o temperatura ambiente durante un mes como máximo y tres subcultivos como máximo (SEIMC).
-
ENAC: la reconstitución y primera siembra de una cepa de colección es una activación, no un pase; el laboratorio debe demostrar que el número de pases no altera sus características y comprobar en cada pase su viabilidad y pureza.
Fuentes: Universidad de Salamanca, curso «Microbiología de los ecosistemas acuáticos», unidad 2, capítulos 2 (Medios de cultivo), 3 (Hongos y levaduras) y 5 (Técnica aséptica, cultivo puro y siembra) (http://aulacidta5.usal.es/aulavirtual/Demos/microbiologia/unidades/curso/UNI_02/u2c2s1.htm y siguientes); Universidad Miguel Hernández, Prácticas de Microbiología: Preparación de medios, Técnicas de aislamiento, Agotamiento de asa, Estrías escocesas, Capacidad hemolítica, Acidificación de hidratos de carbono (https://sites.google.com/a/goumh.umh.es/practicas-de-microbiologia/indice); Universidad de La Rioja, S. A. Sanz Cervera, Prácticas de Microbiología, 2.ª ed., 2011 (https://dialnet.unirioja.es/descarga/libro/100835.pdf); M. D. García López y F. Uruburu (CECT, Universitat de València), La conservación de cepas microbianas (https://www.uv.es/cect2/87_Conservacion_cepas_microbianas); SEIMC, Procedimiento n.º 32 (https://seimc.org/wp-content/uploads/2025/06/seimc-procedimientomicrobiologia32.pdf); ENAC, CEA-ENAC-20 Rev. 2, Criterios específicos de acreditación. Análisis microbiológico, 2023, anexo I (https://www.enac.es/documents/7020/5bdcf1e4-5598-4194-a076-125690f60654). Consultadas el 07/10/2026.