Equipo básico del laboratorio de microbiología II: hornos y autoclaves, esterilización, desinfección, tratamiento de materiales contaminados y preparación del material para cultivo

En el laboratorio de microbiología es imprescindible trabajar con material y soluciones estériles, para que los resultados correspondan a los microorganismos de la muestra y no a contaminantes del medio o de los materiales. Este artículo trata los equipos que esterilizan por calor (autoclave y horno), los demás métodos de esterilización, la desinfección, el destino del material contaminado y la preparación del material antes del cultivo.

1. Conceptos: limpieza, desinfección y esterilización

La esterilización expresa una condición absoluta, pero la destrucción microbiana sigue una ley exponencial: siempre hay una probabilidad finita de supervivencia. Por eso un producto se considera estéril cuando la probabilidad de que contenga un microorganismo viable es de uno entre un millón: es el SAL (Sterility Assurance Level, nivel seguro de esterilidad), que se expresa como 10⁻⁶.

La ebullición no es un procedimiento de esterilización: solo alcanza 100 ºC, insuficiente para eliminar formas de resistencia como las endosporas, aunque reduce la carga de formas vegetativas.

2. Esterilización por calor

2.1. Calor húmedo: el autoclave

El autoclave es un sistema cerrado en el que se forma vapor de agua a presión; con una atmósfera de sobrepresión el agua alcanza 121 ºC, lo que desnaturaliza enzimas y destruye microorganismos y esporas. En el laboratorio se esteriliza habitualmente a 121 ºC durante 20 minutos (Universidad Miguel Hernández). La acción humectante del vapor aumenta la sensibilidad de los gérmenes al calor; como el aire y el vapor no son miscibles, el aire debe eliminarse antes de esterilizar. Los parámetros de la fase de meseta están estandarizados para uso hospitalario (INSALUD):

Fases del ciclo:

1. Purgado: el vapor desplaza el aire, que sale por la válvula de purgado; termina al alcanzar la temperatura de esterilización.

2. Esterilización: con la válvula cerrada y la temperatura seleccionada alcanzada.

3. Descarga: deja de producirse vapor y presión y temperatura bajan poco a poco.

Uso correcto:

• Comprobar que el agua llega a la rejilla o gradilla y que el autoclave queda bien cerrado.

• Para que la esterilización de un medio sea eficaz, la temperatura y el tiempo deben alcanzarse en todo el líquido. Los recipientes con cierre hermético se introducen sin cerrar del todo el tapón, para que entre el vapor. Los recipientes vacíos necesitan más tiempo que los que contienen líquido.

• No abrir la tapa hasta que el manómetro esté a cero. Si se han esterilizado líquidos, hay que dejar que el autoclave se enfríe solo: la descompresión súbita rompe frascos y tubos y provoca derrames (Universidad de La Rioja).

• No introducir sustancias que contengan alcoholes o fenoles (riesgo de explosión); si hay problemas, no abrir hasta que baje la presión y la temperatura sea menor de 80 ºC, con guantes especiales y pantalla facial (SEIMC).

• El autoclave debe estar homologado y certificado para la presión de trabajo, con manómetro, y el aumento de presión y la descompresión deben ser progresivos; su riesgo principal es la explosión (INSST).

2.2. Calor seco: el horno (estufa de esterilización)

El calor seco se emplea básicamente para vidrio y material de laboratorio, polvos y sustancias oleosas; el sistema más conocido es la estufa de Poupinel. Mata por oxidación de los componentes celulares y es un proceso de difusión lenta, por lo que necesita temperaturas altas y mesetas largas (INSALUD):

El calor seco no es corrosivo, inactiva pirógenos a más de 250 ºC y su instalación es sencilla y barata; sus inconvenientes son la larga duración y que no sirve para textiles, caucho ni productos ópticos sensibles. Las esporas son mucho más resistentes al calor seco que al húmedo, porque la falta de agua protege sus proteínas (Ministerio de Sanidad). Como ejemplo de uso, el Instituto de Toxicología de la Defensa esteriliza los envases de muestras de agua en autoclave a 120 ºC durante 30 minutos o por calor seco a 180 ºC durante 2 horas.

2.3. Flameado

El mechero Bunsen crea una zona aséptica de trabajo. El asa de siembra se esteriliza flameándola hasta el rojo incandescente y se enfría antes de tomar la muestra; las bocas de tubos y matraces se flamean ligeramente al destaparlos y tras la inoculación.

3. Otros métodos de esterilización

• Filtración: los microorganismos no se destruyen, sino que quedan retenidos. Solo sirve para fluidos y se usa con soluciones termolábiles (azúcares concentrados, urea, vitaminas, factores de crecimiento). Se usan filtros desechables de nitrocelulosa de 0,45 o 0,22 µm. No retiene virus (más pequeños que el poro) ni micoplasmas (carecen de pared y se deforman).

• Radiaciones: la radiación γ, muy penetrante, esteriliza material termolábil como el plástico comercial; la luz ultravioleta forma dímeros de timina en el ADN, pero penetra muy poco y se limita a superficies y aire.

• Gases y vapores a baja temperatura (material termosensible): óxido de etileno y formaldehído (actúan por alquilación), peróxido de hidrógeno en plasma o vaporizado y ácido peracético (por oxidación).

4. Control de la esterilización

• La prueba de Bowie-Dick evalúa el sistema de vacío de los autoclaves de prevacío (ausencia de aire en la cámara); se realiza a diario antes del primer ciclo y tras una avería o reparación.

• Para el vapor se usan esporas de Geobacillus stearothermophilus, con un control semanal; para el óxido de etileno, esporas de Bacillus atrophaeus, en cada ciclo.

• En el laboratorio de microbiología, la SEIMC recomienda verificar en el autoclave temperatura/tiempo e indicadores químicos en cada carga e indicadores biológicos semanalmente, y validar la uniformidad de la temperatura cada 2 años.

5. Desinfección

Niveles de desinfectante (AEMPS/PRAN):

Desinfectantes más usados:

• Hipoclorito sódico (lejía): a 1.000 ppm de cloro disponible (0,1 %) durante 10 minutos actúa como desinfectante de alto nivel; a 5.000 ppm (0,5 %) y 5 minutos es activo frente a esporas. Es corrosivo para algunos metales y altera plásticos.

• Alcoholes (etanol, isopropanol), habitualmente al 70 %: nivel intermedio (acción moderada sobre micobacterias); son inflamables. En las cabinas de seguridad se usa alcohol al 70 % para desinfectar la superficie (INSST).

• Compuestos de amonio cuaternario: no son de alto nivel (no actúan sobre micobacterias); superficies no críticas.

En el laboratorio (SEIMC): las superficies de trabajo se descontaminan al menos una vez al día y siempre que haya un derrame. Si cae o se derrama un cultivo, se vierte lejía al 0,5 % recién preparada, se cubre con papel y se deja actuar al menos 15 minutos. En un derrame biológico se evacúa la zona durante al menos 30 minutos, se cubre con material absorbente de fuera hacia dentro y se aplica hipoclorito con 5 g/L de cloro libre (dilución al 10 % de lejía doméstica) durante 20-30 minutos.

6. Tratamiento de materiales contaminados

• El laboratorio debe disponer de un sistema de descontaminación de desechos: autoclave, desinfección química, incineración u otro método validado (SEIMC).

• Clasificación de los residuos sanitarios (SEIMC, orientativa: varía según la comunidad autónoma): clase I, generales (cartón, papel, vidrio); clase II, asimilables a urbanos; clase III, especiales o «infecciosos», que pueden estar contaminados con agentes infecciosos; además, cadáveres (IV), químicos (V), citotóxicos (VI) y radiactivos (VII).

• Líquidos: los potencialmente infecciosos se neutralizan con hipoclorito sódico recién preparado antes de eliminarlos por el desagüe; los de micobacteriología o virología pueden autoclavarse o eliminarse en sus recipientes bien cerrados como residuo sólido.

• Sólidos: se tratan por autoclave o incineración. Los ciclos para material limpio pueden no esterilizar toda la masa de un residuo, por lo que se recomienda prolongar el tiempo y aumentar la presión y registrar presión y temperatura de cada ciclo.

• Punzantes y cortantes: en recipientes rígidos o semirrígidos, resistentes a la punción y con cierre seguro.

• Los contenedores de residuos biológicos se cierran antes de salir del laboratorio; el material reutilizable se empaqueta para su posterior esterilización.

7. Preparación del material para cultivo

• Medios de cultivo: la mayoría se comercializan deshidratados; se pesa la cantidad indicada por el fabricante y se disuelve en agua destilada. Los medios con agar se calientan hasta su completa disolución; los líquidos solo se agitan. Las sustancias termolábiles se esterilizan por filtración y se añaden después del autoclave.

• Reparto antes de esterilizar: caldos en tubos o matraces sin superar 1/3 del volumen del recipiente; los medios sólidos fundidos se reparten en tubos o frascos (no en placas). Los tubos de caldo pueden llevar 2-4 mL con tapón de aluminio; los matraces se tapan con tapón de algodón y papel de aluminio y se autoclavan a 121 ºC durante 15-20 minutos.

• Tras el autoclave: los tubos de medio sólido se inclinan para obtener agar inclinado (slant); las placas se vierten cerca de la llama. Los medios esterilizados pueden conservarse a temperatura ambiente, pero es preferible a 4 ºC para reducir su deshidratación.

• Envases de muestras: vidrio neutro o plástico, muy limpios y estériles.

• Técnica aséptica al usarlo: trabajar junto a la llama, no dejar las tapas de las placas sobre la mesa y mantener inclinados los tubos abiertos.

Fuentes: Universidad Miguel Hernández, Prácticas de Microbiología: Esterilización, desinfección y antisepsis; Autoclave; Ebullición; Filtración; Radiaciones UV; Preparación de medios de cultivo (https://sites.google.com/a/goumh.umh.es/practicas-de-microbiologia/indice); Universidad de La Rioja, S. A. Sanz Cervera, Prácticas de Microbiología, 2.ª ed., 2011 (https://dialnet.unirioja.es/descarga/libro/100835.pdf); Universidad de Salamanca, curso «Microbiología de los ecosistemas acuáticos», capítulo 5 Técnica aséptica (http://aulacidta5.usal.es/aulavirtual/Demos/microbiologia/unidades/curso/UNI_02/u2c5s1.htm); Ministerio de Sanidad, Unidad central de esterilización: estándares y recomendaciones, 2011 (https://www.sanidad.gob.es/areas/calidadAsistencial/excelenciaClinica/docs/Central_de_Esterilizacion.pdf); INSALUD, Manual de gestión de los procesos de esterilización y desinfección del material sanitario, 1999 (https://ingesa.sanidad.gob.es/dam/jcr:03766f4e-cd2e-4e2e-829f-b0c49cfd9d94/Manual_esteriliza_material.pdf); AEMPS, PRAN, Recomendaciones para la desinfección y esterilización de los materiales sanitarios, 2017 (https://www.resistenciaantibioticos.es/sites/default/files/documentos/recomendaciones_desinfeccion_y_esterilizacion_materiales.pdf); SEIMC, Procedimientos n.º 10a (Seguridad en el laboratorio) y n.º 32 (ISO 15189) (https://seimc.org/wp-content/uploads/2025/06/seimc-procedimientomicrobiologia10a.pdf; https://seimc.org/wp-content/uploads/2025/06/seimc-procedimientomicrobiologia32.pdf); INSST, NTP 433 y NTP 1202 (https://www.insst.es/ntp-notas-tecnicas-de-prevencion); Instituto de Toxicología de la Defensa, Análisis de aguas: condiciones generales para la toma de muestras, 2016 (https://www.defensa.gob.es/documents/999074/1000840/ANALISIS_DE_AGUAS_TOMA_DE_MUESTRAS_PISCINAS.pdf). Consultadas el 07/10/2026.