Equipo básico del laboratorio de microbiología I: microscopios, estufas y baños de incubación, centrífugas y cabinas de seguridad

El trabajo diario de un laboratorio de microbiología se apoya en un pequeño grupo de equipos: el microscopio, para observar los microorganismos; las estufas y los baños, para incubarlos a temperatura controlada; la centrífuga, para separar o concentrar; y la cabina de seguridad biológica (CSB), para manipularlos sin exponerse ni contaminar la muestra. Este artículo describe su fundamento, su uso y sus riesgos.

1. Microscopios

1.1. Fundamento: aumento, contraste y resolución

Las células bacterianas y fúngicas, las algas microscópicas y los protozoos se miden en micras (µm); los virus y las estructuras celulares, en nanómetros (nm). En todo microscopio la calidad de la imagen depende de tres factores: aumento, contraste y resolución.

• Aumento: lo produce una lente convexa. Los microscopios actuales son compuestos (más de una lente).

• Contraste: diferencia de intensidad luminosa que permite distinguir el objeto del fondo. Es el principal problema al observar microorganismos, porque la mayoría carecen de color; por eso suele ser necesario teñirlos o usar microscopios con dispositivos que aumentan el contraste (contraste de fases, campo oscuro).

• Límite de resolución (LR): mínima distancia a la que deben estar dos puntos para verse separados. El poder de resolución es mayor cuanto menor es el límite (PR = 1/LR). Depende del sistema de lentes, no del objeto: del objetivo, de la longitud de onda de la luz y del índice de refracción del medio entre objetivo y preparación, que condiciona la apertura numérica. La resolución mejora al disminuir la longitud de onda (luz ultravioleta, haces de electrones) o al aumentar la apertura numérica.

• El objetivo de inmersión se usa sumergido en un aceite especial colocado entre el portaobjetos y el objetivo: el índice de refracción del aceite (1,5) es mayor que el del aire (1,0).

1.2. Partes y aumento total

Los microscopios modernos llevan tres sistemas de lentes: condensador, objetivo y ocular. En el microscopio de campo claro la fuente de luz está en la base; la luz atraviesa un filtro azul (elimina longitudes de onda largas) y el condensador, que la dirige sobre la muestra. La luz transmitida entra en el objetivo, que forma la primera imagen en el tubo; el ocular la vuelve a aumentar.

El aumento total es el producto del aumento del objetivo por el del ocular. El objetivo de bajo poder tiene un campo de visión grande; el de inmersión, un campo pequeño pero más detalle.

Manejo con el objetivo de inmersión: se pone una gota de aceite sobre la preparación, se aproxima con el tornillo macrométrico mirando desde fuera hasta que el objetivo toque el aceite; después, mirando por el ocular, se hace el enfoque grosero con el mismo tornillo y se ajusta con el micrométrico.

1.3. Tipos de microscopio

Los microscopios electrónicos iluminan con un haz de electrones de longitud de onda muy corta. El de transmisión (MET) distingue puntos separados 1 nm, frente a los 200 nm del límite de resolución del microscopio óptico, y puede llegar a 200.000x; exige cortes ultrafinos, criofractura o sombreado metálico. El de barrido (MEB) recoge electrones secundarios emitidos por la superficie y da imágenes tridimensionales (LR de unos 20 nm y unos 100.000 aumentos útiles); las muestras se recubren de oro o platino.

1.4. Mantenimiento

Según la SEIMC, el mantenimiento de los microscopios consiste en limpieza, inspección de posibles daños y comprobación general; sus características se comprueban inicialmente o cuando cambia algún componente, y se realinean cada 6 meses o antes si es necesario.

2. Estufas y baños de incubación

2.1. Para qué sirven

Los métodos para obtener una temperatura constante en el cultivo in vitro son:

1. La estufa de cultivo, en la que puede haber oscilaciones de 1 a 3 ºC.

2. El baño termostatizado, que mantiene la temperatura de forma más estable: sus oscilaciones suelen ser inferiores a 1 ºC.

Algunas técnicas, sobre todo serológicas, tienen fases a temperatura ambiente o en estufas o baños, generalmente a 37 ºC. Las cámaras o estufas de cultivo grandes cuya temperatura es crítica deben mantenerse, por ejemplo, entre 35 ± 2 ºC; si el termómetro tiene una incertidumbre < 1 ºC, el intervalo tolerado en la lectura será 35 ± 1 ºC.

2.2. Estufas especiales

• Estufas de CO2: permiten el crecimiento de microorganismos que lo requieren (la SEIMC cita el meningococo). Se verifican a diario temperatura y nivel de CO2, semanalmente la humedad, y se puede usar un control biológico (Neisseria gonorrhoeae).

• Estufas de anaerobiosis: se retira el oxígeno con una bomba de vacío y el residual con nitrógeno; a menudo se añade CO2. Regulando CO2 y O2 se obtienen atmósferas microaerófilas.

• Jarras de anaerobiosis: recipiente hermético con un sobre generador de atmósfera, un catalizador de paladio en la tapa y un indicador que confirma la anaerobiosis; la jarra se incuba en una estufa normal.

2.3. Control y seguridad

• La temperatura de los aparatos de temperatura controlada (cámaras, estufas, refrigeradores, congeladores, baños) se verifica a diario o en cada uso; su caracterización (uniformidad, estabilidad, incertidumbre) se recomienda cada 2 años en cámaras o estufas grandes (SEIMC).

• Estufas: riesgos de explosión, incendio e intoxicación si se desprenden vapores inflamables, de sobrecalentamiento por fallo del termostato y de contacto eléctrico indirecto. Se recomiendan sistemas de seguridad de control de temperatura (por ejemplo, doble termostato) y mantenimiento de la toma de tierra (INSST). No se deben sobrepasar los límites de temperatura del equipo ni introducir productos químicos corrosivos (SEIMC).

• Baños calientes: riesgo de quemaduras, rotura de vidrio ordinario y contacto eléctrico. No llenarlos hasta el borde, asegurar su estabilidad, usar vidrio tipo Pyrex, disponer de termostato de seguridad y mantenimiento preventivo (INSST).

3. Centrífugas

En el laboratorio de microbiología la centrífuga se usa sobre todo para concentrar una muestra: tras centrifugar se desecha el sobrenadante y se siembra u observa el sedimento. Las condiciones se indican en fuerza centrífuga (×g) o en revoluciones por minuto (rpm) y tiempo; por ejemplo, la SEIMC indica concentrar ciertas muestras líquidas a 1.500 ×g durante 10 minutos y, en otro procedimiento, centrifugar 15 minutos a 3.000 rpm.

3.1. Riesgos

Según el INSST: rotura del rotor, heridas por contacto con la parte giratoria, explosión por atmósfera inflamable y formación de bioaerosoles. La SEIMC señala que los mayores riesgos derivan de los aerosoles generados al centrifugar material biológico o por rotura de tubos.

3.2. Normas de uso

• Repartir la carga simétricamente; cestillos y soportes correctamente equilibrados.

• La centrífuga debe tener un mecanismo que impida ponerla en marcha con la tapa mal cerrada y abrirla con el rotor en movimiento; no se usan centrífugas sin cierre de seguridad ni se manipulan hasta que el rotor se haya detenido por completo.

• Con material potencialmente infeccioso: tubos bien cerrados y rotores o cestillos de seguridad.

• Disponer de un procedimiento para roturas (INSST, NTP 616): si se rompe un tubo con el aparato en marcha, se interrumpe la centrifugación y no se abre hasta pasados unos 30 minutos, para que sedimente el bioaerosol; los vidrios se recogen con guantes resistentes y pinzas, y la cubeta y el rotor se limpian con desinfectante (no se aconseja la lejía, que podría dañar el instrumental). Los cestillos de seguridad se abren en una CSB. La rotura se comunica al responsable de seguridad (SEIMC).

• Control: equilibrar la carga y comprobar el funcionamiento general a diario o en cada uso; calibrar la velocidad frente a un tacómetro trazable anualmente, solo en las centrífugas críticas para el resultado (SEIMC).

4. Cabinas de seguridad biológica

4.1. Concepto

Las CSB son barreras físicas primarias: recintos cerrados con circulación forzada de aire que confinan el agente en el área de manipulación y protegen a la persona trabajadora y al entorno; algunas protegen también el producto. Las define la norma UNE-EN 12469. Su uso está indicado o es exigible cuando el procedimiento puede generar bioaerosoles peligrosos: centrifugación, trituración, mezclado, agitación, disrupción sónica o apertura de envases con presión interna distinta de la ambiental (anexo IV del RD 664/1997, según el INSST).

Elementos comunes: flujo de aire direccional, filtros HEPA de clase H14 o superior, con una eficiencia del 99,995 % para el tamaño de partícula más difícil de retener (0,3 µm), y diferencias de presión internas, con monitorización del flujo y alarmas.

Una cabina de flujo laminar no es una CSB: protege el producto, pero el aire evacuado no se filtra necesariamente; en las de flujo horizontal el aire que barre la muestra sale hacia el trabajador. No debe usarse con agentes infecciosos, tóxicos o alérgicos.

4.2. Clases

• Clase I: trabaja a presión negativa; no protege el material.

• Clase II: el flujo descendente de aire estéril se divide a unos 6-18 cm de la superficie hacia las rejillas frontal y trasera. La norma estadounidense NSF/ANSI 49 distingue los tipos A1, A2, B1, B2 y C1; en los A se recircula el 70 % y se expulsa el 30 %, y en la B2 se evacua el 100 %.

• Clase III: totalmente cerrada, presión negativa de al menos 200 Pa, con caja de paso o autoclave de doble puerta; se usa con agentes del grupo 4.

Selección: según el grupo de riesgo del agente y la actividad. La clase I puede usarse con grupos 1 y 2, aunque el grupo 2 se suele manejar en clase II; los agentes más peligrosos requieren clase III. Los filtros HEPA no retienen gases ni vapores químicos.

4.3. Instalación, certificación y uso

• Ubicarla lejos de corrientes de aire (puertas, ventanas, tránsito, rejillas de climatización), con unos 30 cm libres detrás y a los lados y 45 cm por encima.

• Certificar su funcionamiento al instalarla y, al menos, una vez al año, al cambiarla de sitio o tras el mantenimiento (integridad y fugas de los HEPA, velocidades, presión, alarmas).

• Antes: apagar la lámpara UV, encender ventilador y fluorescente y dejarla funcionar 5-10 minutos; desinfectar la superficie (por ejemplo, alcohol al 70 %); no introducir materiales que desprendan partículas (papel, madera, tapones de algodón); colocar todo de limpio a contaminado y dejar que el aire barra 3-5 minutos.

• Durante: movimientos lentos; elementos a 10 cm como mínimo detrás de la rejilla frontal; no tapar las rejillas; evitar llamas; tras introducir material, esperar 2-3 minutos; una sola persona cada vez.

• Al terminar: desinfectar el material antes de sacarlo, retirar residuos según protocolo, apagar y, en su caso, encender la UV. La zona de trabajo no es un almacén.

• Descontaminación: desinfección tras cada uso; descontaminación por gases o vapor (frecuentemente peróxido de hidrógeno vaporizado) antes de moverla, al cambiar de agente, tras derrames o antes de cambiar filtros.

Fuentes: Universidad de Salamanca, curso «Microbiología de los ecosistemas acuáticos», unidad 2 (http://aulacidta5.usal.es/aulavirtual/Demos/microbiologia/unidades/curso/UNI_02/u2c1s1.htm y siguientes) y capítulo 3 «Métodos de estudio de los microorganismos» (http://aulacidta5.usal.es/aulavirtual/Demos/microbiologia/unidades/documen/uni_02/56/cap304.htm); Universidad Miguel Hernández, Prácticas de Microbiología: Observación microscópica y Temperatura (https://sites.google.com/a/goumh.umh.es/practicas-de-microbiologia/indice); SEIMC, Procedimiento en Microbiología Clínica n.º 32, Recomendaciones para la implantación de la norma ISO 15189 (https://seimc.org/wp-content/uploads/2025/06/seimc-procedimientomicrobiologia32.pdf) n.º 10a, Seguridad en el laboratorio de Microbiología Clínica (https://seimc.org/wp-content/uploads/2025/06/seimc-procedimientomicrobiologia10a.pdf), n.º 21, Diagnóstico microbiológico de las micosis (https://seimc.org/wp-content/uploads/2025/06/seimc-procedimientomicrobiologia21.pdf) y n.º 61, Métodos microbiológicos para la monitorización de la limpieza, desinfección y esterilización de dispositivos médicos (https://seimc.org/wp-content/uploads/2025/06/seimc-procedimientomicrobiologia61.pdf); INSST, NTP 433 Prevención del riesgo en el laboratorio: instalaciones, material de laboratorio y equipos, NTP 616 Riesgos biológicos en la utilización, mantenimiento y reparación de instrumentos de laboratorio y NTP 1202 (2024) Cabinas de seguridad biológica (https://www.insst.es/ntp-notas-tecnicas-de-prevencion). Consultadas el 07/10/2026.