Validación de procedimientos analíticos

Validar un procedimiento analítico es demostrar, con datos experimentales, que el método sirve para el uso que se le va a dar. Este tema recorre la definición de validación, el rango en que se valida, los criterios con que se juzga, la sistemática de trabajo y el cálculo de la incertidumbre de medida, siguiendo las guías Eurachem/CITAC, el Vocabulario Internacional de Metrología (VIM) y los criterios de ENAC.

1. Definición

1.1. Validación

La Guía Eurachem La adecuación al uso de los métodos analíticos recoge tres definiciones de validación:

En palabras de la guía, validar un método es «básicamente el proceso para definir un requisito analítico, y la confirmación de que cuenta con capacidades consistentes con las aplicaciones requeridas». La validación permite al laboratorio demostrar que el método es «adecuado para el uso previsto» (fitness for purpose). Además, la validación formal debe hacerse sobre la versión final del método, es decir, sobre el procedimiento documentado.

1.2. Validación y verificación

El VIM define la verificación (2.44) como la «aportación de evidencia objetiva de que un elemento dado satisface los requisitos especificados». La diferencia práctica, según Eurachem:

• Validación: necesaria cuando hay que demostrar que las características de desempeño del método son adecuadas para el uso previsto. La guía cita como casos a validar los métodos no normalizados, los diseñados o desarrollados por el laboratorio, los normalizados usados fuera de su ámbito de aplicación y las ampliaciones o modificaciones de métodos normalizados. También hay que validar cuando se quiere demostrar la equivalencia de los resultados de dos métodos.

• Verificación: cuando el laboratorio adopta un método ya validado, por ejemplo una norma, debe confirmar que es capaz de aplicarlo. Esto exige algún trabajo experimental, pero menor que una validación completa. También hace falta verificar cuando hay cambios importantes: un equipo nuevo (aunque sea similar), un traslado de equipos, una actualización del software o resultados de control de calidad que indiquen que el desempeño cambia con el tiempo.

ENAC aplica este criterio en el Anexo I del documento CGA-ENAC-LEC:

• Métodos normalizados: métodos en vigor publicados en normas internacionales, regionales o nacionales (UNE, EN, ISO…), por organizaciones técnicas reconocidas, en textos o revistas científicas aceptados en el sector, o especificados por los fabricantes de equipos.

• Métodos internos basados en métodos normalizados: su validez se justifica por referencia al método normalizado.

• Métodos internos desarrollados por el laboratorio: cualquier otro.

Para los dos primeros tipos basta la verificación antes de usarlos. ENAC cita la cláusula 7.2.1.5 de la norma: el laboratorio «debe verificar que puede llevar a cabo apropiadamente los métodos antes de utilizarlos» y debe conservar registros de esa verificación. Para los métodos desarrollados por el laboratorio exige una validación completa conforme a la cláusula 7.2.2, con evidencias que demuestren «de manera indiscutible la validez del método». Si el laboratorio elige un método propio existiendo uno normalizado, debe justificarlo técnicamente. ENAC considera además que un método normalizado pierde esa condición un año después de aprobarse una nueva revisión, salvo indicación expresa de su propietario o que un texto reglamentario cite la revisión anterior.

2. Rango de validación

El rango de validación se corresponde con el intervalo de trabajo: el intervalo en el que el método da resultados con una incertidumbre aceptable, según la Guía Eurachem. El VIM lo llama «intervalo de medida» o «intervalo de trabajo».

• El extremo inferior lo marca el límite de cuantificación (LOQ).

• El extremo superior lo marcan las concentraciones a las que aparecen anomalías significativas en la sensibilidad analítica, como el efecto meseta a absorbancias altas en espectroscopía UV/VIS.

El intervalo de trabajo del método debe figurar en el alcance del procedimiento documentado. Durante la validación hay que confirmar que el método funciona en todo ese intervalo y para cada matriz cubierta por el alcance, porque las interferencias pueden producir respuestas no lineales y la extracción del analito puede variar con la matriz.

Eurachem distingue dos intervalos de trabajo:

• Del instrumento: se expresa en concentración de la muestra ya procesada que se presenta al instrumento, por ejemplo en mg L⁻¹ de un extracto.

• Del método: se refiere a la concentración de la muestra de laboratorio, por ejemplo en mg kg⁻¹ de una muestra sólida.

Cómo se estudia (Referencia Rápida 5 de Eurachem):

1. Medir un blanco y patrones de calibración a 6-10 concentraciones espaciadas uniformemente, representar la respuesta frente a la concentración y localizar visualmente el rango lineal aproximado.

2. Repetir el blanco y los patrones 2-3 veces a 6-10 concentraciones dentro del rango lineal, calcular la regresión y representar los residuales. Si los residuales se reparten al azar en torno a cero, la relación es lineal. Si muestran una tendencia sistemática, no es lineal o la varianza cambia con el nivel.

3. Calibrar según el procedimiento propuesto y medir materiales de referencia o blancos de muestra adicionados (2-3 veces a 6-10 concentraciones), siguiendo el método documentado completo.

La guía recomienda que los patrones cubran el rango esperado ampliado en ± 10 % o incluso ± 20 %. Por ejemplo, para un rango de 1 a 100 mg L⁻¹, ± 20 % supone estudiar de 0,8 a 120 mg L⁻¹. Si la desviación estándar es proporcional a la concentración, conviene usar una regresión ponderada. La guía no recomienda, por lo general, funciones de grado superior al cuadrático.

3. Criterios de validación

3.1. El requisito analítico

La validación empieza por fijar el requisito analítico: las características de desempeño que debe cumplir el método para resolver la necesidad del cliente. Eurachem advierte que algunas normas legales obligan a usar métodos concretos y que la UE ha publicado requisitos para el análisis del agua de consumo humano, entre otros. Cuando no hay requisito externo, el criterio suele basarse en la capacidad conocida del método, por ejemplo la publicada en métodos normalizados o la observada en ensayos de aptitud.

3.2. Características de desempeño

Son las características que se evalúan habitualmente (Tabla 2 de Eurachem):

En s₀′, s₀ es la desviación estándar de resultados próximos a cero. Si cada resultado de rutina se corrige con un blanco, se multiplica por √(1/n + 1/n_b), donde n es el número de réplicas que se promedian y n_b el número de blancos usados en la corrección. Ejemplo de Eurachem: con s₀ = 1 mg kg⁻¹, n = 1 y n_b = 1, se obtiene s₀′ = 1 · √2 = 1,4 mg kg⁻¹. Hay que distinguir el LOD del instrumento (blancos presentados directamente al equipo) del LOD del método (muestras sometidas a todo el procedimiento). Para la validación interesa este último.

Precisión según las condiciones de medida:

Eurachem indica entre 6 y 15 réplicas por material y que cada réplica repita el proceso completo, incluida la preparación de la muestra. El límite de repetibilidad permite decidir si dos resultados duplicados difieren significativamente: r = 2 · t · s_r. Con muchos grados de libertad y al 95 % de confianza, se aproxima a r = 2,8 · s_r.

Veracidad, por tres vías (Referencia Rápida 6 de Eurachem):

• a) Analizar un material de referencia, preferiblemente un MRC de matriz similar a las muestras, unas 10 veces.

• b) Hacer estudios de recuperación con muestras adicionadas. La recuperación relativa de adiciones es R′(%) = (x̄′ − x̄) / x_adición · 100. Eurachem advierte que el analito añadido suele estar menos ligado a la matriz que el nativo, por lo que esta vía puede ser demasiado optimista.

• c) Comparar los resultados con un método de referencia o con el método en uso.

Un mismo MR no debe usarse a la vez para calibrar y para evaluar el sesgo. El sesgo total combina el sesgo del método y el sesgo del laboratorio. En los métodos empíricos, también llamados «definidos operativamente», el sesgo del método es cero por definición.

3.3. Criterios reglamentarios: el agua de consumo (RD 3/2023)

En el control del agua de consumo, los criterios no los elige el laboratorio. El anexo III, parte D, del Real Decreto 3/2023 exige que el método mida concentraciones iguales al valor paramétrico con un límite de cuantificación igual o inferior al 30 % del valor paramétrico y con la incertidumbre máxima (k = 2) que fija su Tabla 15, expresada en % del valor paramétrico. Algunos ejemplos: nitrato 15 %, arsénico 30 %, cadmio 25 %, ácidos haloacéticos 50 %, y pH 0,2 unidades. Esa incertidumbre «no se utilizará como tolerancia adicional a los valores paramétricos». El anexo define el límite de detección como el valor por encima del cual se puede afirmar, con un nivel de confianza declarado, que una muestra es distinta de un blanco. Define el límite de cuantificación como un múltiplo constante del de detección que se puede determinar «con un grado aceptable de exactitud y precisión». Ambos deben ser siempre inferiores al valor paramétrico o al valor de referencia. Los laboratorios notifican en SINAC sus acreditaciones, la incertidumbre, el LC y el LD de cada método.

4. Sistemática de validación

4.1. El proceso

La Figura 1 de Eurachem describe un ciclo: necesidad del cliente → requisitos analíticos → identificar, modificar o desarrollar un método → evaluar su desempeño → ¿se adecúa al uso? Si se adecúa, se emite el informe de validación y se usa el método. Si no se adecúa, se continúa el desarrollo, se redefinen los requisitos o se concluye que el método no puede utilizarse. El proceso termina con una declaración de si cumple o no el requisito.

Hay dos estrategias fundamentales:

• Estudios interlaboratorios (colaborativos): habituales para métodos normalizados (familia ISO 5725). El usuario solo tiene que verificar los datos publicados.

• Validación en un solo laboratorio: para métodos propios.

La extensión de la validación depende de la aplicación, de la naturaleza de los cambios introducidos y de las circunstancias de uso. Eurachem la describe como «un equilibrio entre costos, riesgos y posibilidades técnicas».

4.2. Plan e informe de validación

Eurachem propone un modelo que combina plan e informe:

• Título: método, fecha y autores.

• Alcance: analito, mensurando, unidades, tipo de muestra y uso previsto.

• Planificación: propósito y extensión de la validación.

• Características de desempeño: experimentos, resultados y conclusiones de cada una.

• Resumen: con la declaración sobre la adecuación al uso, que es un requisito de la ISO/IEC 17025.

El RD 3/2023 (anexo III, parte E) pide igualmente que el laboratorio registre los resultados, el procedimiento de validación y «una declaración sobre la aptitud del método para el uso previsto». Para los métodos físico-químicos enumera estos parámetros: selectividad, rango de trabajo, linealidad, sensibilidad, límite de detección, límite de cuantificación, robustez, precisión, veracidad (sesgo) e incertidumbre. En función del método, el laboratorio los evaluará todos o una parte. Para los métodos microbiológicos cualitativos exige, como mínimo, el límite de detección. Para los cuantitativos exige estudios de recuperación y precisión en todo el rango de trabajo.

4.3. Herramientas

La robustez se estudia con cambios deliberados en el método. Con un diseño de Plackett-Burman se pueden estudiar 7 parámetros en 8 experimentos. Las variables críticas se recogen en el procedimiento como límites de tolerancia.

5. Cálculos de incertidumbres

5.1. Conceptos

El VIM 3 (2.26) define la incertidumbre de medida como el «parámetro no negativo que caracteriza la dispersión de los valores atribuidos a un mensurando, a partir de la información que se utiliza». La Guía Eurachem/CITAC Cuantificación de la incertidumbre en medidas analíticas (QUAM, CG 4) aclara varios conceptos:

• Error e incertidumbre son distintos. El error es un valor único: la diferencia entre un resultado y el valor verdadero o de referencia. En principio puede corregirse. La incertidumbre es un intervalo y no sirve para corregir un resultado.

• El error aleatorio no se puede compensar, pero se reduce aumentando el número de observaciones. El error sistemático permanece constante o varía de forma predecible y no se reduce repitiendo medidas. El resultado debe corregirse por todos los efectos sistemáticos significativos reconocidos.

• Las equivocaciones, como un dígito transpuesto o una burbuja en la cubeta, invalidan la medida: se rechazan y no se incorporan a la incertidumbre.

• Cada contribución es un componente. Expresada como desviación estándar, se llama incertidumbre estándar (u). Su combinación da la incertidumbre estándar combinada u_c(y). Multiplicada por un factor de cobertura k da la incertidumbre expandida U = k · u_c. Para un nivel de confianza aproximado del 95 %, k es habitualmente 2.

• Los componentes pueden evaluarse por métodos de tipo A (estadística de series de medidas) o de tipo B (distribuciones supuestas a partir de la experiencia u otra información).

5.2. Las cuatro etapas (QUAM)

1. Especificar el mensurando: qué se mide, sobre qué material y con qué expresión de cálculo. Incluye aclarar si el muestreo forma parte del procedimiento y si el método es empírico, como la «grasa extraíble», cuyo resultado depende de las condiciones especificadas.

2. Identificar las fuentes de incertidumbre: definición incompleta del mensurando, muestreo, efectos de matriz e interferencias, condiciones ambientales, incertidumbre de los equipos másicos y volumétricos, valores de referencia, aproximaciones del método y variaciones aleatorias. Suele empezarse por la ecuación de cálculo y puede apoyarse en un diagrama causa-efecto.

3. Cuantificar los componentes, aprovechando cuando sea posible los datos de validación y de control de calidad.

4. Calcular la incertidumbre combinada y aplicar el factor de cobertura.

5.3. Conversión a incertidumbre estándar (QUAM 8.1)

5.4. Combinación

La relación general es la ley de propagación: u_c(y) = √[Σ cᵢ² · u(xᵢ)²], donde cᵢ = ∂y/∂xᵢ es el coeficiente de sensibilidad. Si las variables no son independientes, se añaden términos de covarianza. QUAM da dos reglas sencillas:

• Regla 1 (sumas y restas): u_c(y) = √[u(p)² + u(q)² + …]

• Regla 2 (productos y cocientes): u_c(y)/y = √[(u(p)/p)² + (u(q)/q)² + …], es decir, se combinan las incertidumbres relativas.

En los casos complejos recomienda métodos numéricos: la hoja de cálculo de Kragten o la simulación Monte Carlo.

5.5. Estimación a partir de los datos de validación

Eurachem recuerda que la mayor parte de la información para evaluar la incertidumbre se obtiene en la validación. Una estimación debe tener en cuenta:

• la precisión a largo plazo (precisión intermedia o reproducibilidad);

• el sesgo y su incertidumbre, incluida la del valor de referencia;

• la calibración de equipos, aunque la de balanzas, termómetros, pipetas y matraces suele ser insignificante frente a la precisión global;

• cualquier otro efecto significativo, por ejemplo intervalos de temperatura o tiempo permitidos por el método, que pueden cuantificarse con estudios de robustez.

El RD 3/2023 (anexo III, parte E.4) añade que, a partir de las incertidumbres expandidas obtenidas a distintos niveles (incluido el LOQ) y en distintas matrices, se asigna una incertidumbre del método. Puede ser distinta según el nivel de concentración o la más desfavorable de las evaluadas.

5.6. Informar la incertidumbre

QUAM pide dar información suficiente para que el resultado pueda reevaluarse: los métodos de cálculo, los valores y fuentes de correcciones y constantes, y la lista de componentes con cómo se evaluó cada uno. Cuando la regla de decisión acordada con el cliente es la de aceptación simple, ENAC (CGA-ENAC-LEC, C 7.8.6) exige que el laboratorio informe siempre del valor de la incertidumbre. Para las incertidumbres de ensayo, ENAC remite al documento ILAC G17.

Fuentes: Eurachem, La adecuación al uso de los métodos analíticos, 2.ª ed. inglesa / 1.ª española, 2016 (https://www.eurachem.org/images/stories/Guides/pdf/MV_guide_2nd_ed_ES.pdf); Eurachem/CITAC, Guía CG 4 Cuantificación de la incertidumbre en medidas analíticas, QUAM:2012.P1-ES (https://www.eurachem.org/images/stories/Guides/pdf/QUAM2012_P1_ES.pdf); CEM, Vocabulario Internacional de Metrología VIM, 3.ª ed. 2012 (https://www.cem.es/sites/default/files/vim-cem-2012web.pdf); ENAC, CGA-ENAC-LEC Rev. 12, abril 2024 (https://www.enac.es/documents/7020/b7e24234-daba-4a62-9652-76eb7e96db30); Real Decreto 3/2023, anexo III (https://www.boe.es/buscar/act.php?id=BOE-A-2023-628). Consultadas el 07/10/2026.