El Museo Sefardí tiene su sede en la Sinagoga del Tránsito, situada en la antigua judería de Toledo. El edificio, considerado una de las sinagogas medievales mejor conservadas del mundo, fue erigido a mediados del siglo XIV, hacia 1357, bajo el mecenazgo de Samuel ha-Leví Abulafia, tesorero (almojarife) y consejero del rey Pedro I de Castilla. Por ello se la conoce también como Sinagoga de Samuel ha-Leví.
La sinagoga es una obra maestra del arte mudéjar. Su gran sala de oración, de planta rectangular, está cubierta por un rico artesonado de madera y decorada en su parte superior con finas yeserías de motivos vegetales, geométricos y epigráficos. Entre la decoración destacan las inscripciones hebreas —con textos de los Salmos y alabanzas al rey Pedro I y al propio Samuel ha-Leví— combinadas, de forma singular, con emblemas heráldicos del reino de Castilla y León. Los muros inferiores permanecen más sobrios, mientras que la zona alta despliega una ornamentación de gran riqueza.
Samuel ha-Leví llegó a acumular una notable fortuna y poder gracias a su cargo, pero acabó cayendo en desgracia: fue detenido y murió, y sus bienes fueron confiscados. Tras la expulsión de los judíos decretada por los Reyes Católicos en 1492, el edificio dejó de tener uso sinagogal. Los Reyes Católicos lo cedieron a la Orden de Calatrava, que lo transformó en iglesia. El nombre "del Tránsito" procede de época posterior y alude a un cuadro del Tránsito de la Virgen que presidió el templo.
El Museo Sefardí fue creado por Decreto en 1964, con la finalidad de conservar y difundir el patrimonio cultural hispanojudío y sefardí. En 1968 recibió la consideración de Museo Nacional de Arte Hispanojudío. Su exposición permanente recorre la historia de los judíos en España: su llegada a la Península en época romana, su etapa de esplendor cultural durante la Edad Media, la convivencia y los conflictos con cristianos y musulmanes, el fenómeno de las conversiones, la actuación de la Inquisición y, finalmente, la expulsión de 1492 y la posterior diáspora sefardí por el Mediterráneo, Europa y otros continentes.
El término "sefardí" deriva de Sefarad, nombre con el que la tradición judía designa a la Península Ibérica. Los sefardíes conservaron durante siglos, en el exilio, su lengua —el judeoespañol o ladino— y numerosas tradiciones. Junto a la sala de oración, el museo ocupa dependencias anexas donde se exhiben piezas de ritual, textiles, documentos, lápidas funerarias y otros objetos que ilustran la vida religiosa y cotidiana de las comunidades judías, convirtiéndose en el gran centro de referencia de la cultura sefardí en España.